Pré-validação do ensaio de potência in vitro para veneno botrópico e soro antibotrópico
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Data de Publicação: | 2017 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35613 |
Resumo: | Acidentes com animais peçonhentos são a segunda causa de intoxicação em humanos no Brasil. Na América Central e do Sul a incidência destes acidentes é predominantemente por serpentes do gênero Bothrops. No Brasil em 2015 foram notificados 24.467 acidentes dentre os quais 73,5% causados pelo gênero Bothrops. No Instituto Nacional de Controle de qualidade em Saúde (INCQS) são utilizados aproximadamente 5.500 camundongos/ano somente para os ensaios de potência de antivenenos botrópico e crotálico, portanto é importante o desenvolvimento de uma metodologia alternativa ao uso de animais. O INCQS possui um grupo de pesquisadores engajados na busca por métodos alternativos ao uso de animais desde 1999. O objetivo deste trabalho é pré-validar um método alternativo in vitro para a determinação da potência do veneno botrópico e do soro antibotrópico. O princípio da técnica proposta baseia-se na propriedade do veneno botrópico provocar efeito citotóxico em células Vero de rim de macaco e sua inibição pelo antiveneno. A concentração de células aderidas pode ser avaliada pela coloração e posterior eluição do corante, sendo a densidade óptica do eluato do corante diretamente proporcional à concentração de células vivas. Um método alternativo validado deve passar por todas as fases de desenvolvimento, pré-validação, validação e revisão por especialistas conferindo credibilidade através dos Centros de Validações. A pré-validação é importante antes da realização de um estudo formal de validação em larga escala, deve envolver a otimização e padronização do protocolo, a identificação de qualquer problema inesperado, incluindo aqueles relacionados à análise dos resultados, bem como uma avaliação inicial da transferibilidade interlaboratorial do método. Este estudo pretende pré-validar uma metodologia mais eficiente do que a recomendada atualmente e que é mais rápida, visando reduzir o custo através da redução de insumos, materiais utilizados e tempo para liberar lotes de veneno e antiveneno. O método proposto é capaz de quantificar o efeito citotóxico de metaloproteases e fosfolipases A2, principais toxinas presentes no veneno de B. jararaca. A potência in vitro do Veneno Botrópico de Referência foi de 4,18 μg/mL e para o Soro Antibotrópico de Referência foi de 0,126 μl / mL. O ensaio de potência do Veneno Botrópico teve o coeficiente de variação geométrico (gCV) interensaios de 27,79% e o gCV intraensaios de 14,76%. Para a potência do Soro Antibotrópico de Referência o resultado obtido de gCV intraensaio foi 7,52% e o gCV interensaio foi 7,59%. O método apresentou linearidade válida (p>0,05) para todos os ensaios. Os resultados obtidos demonstram que o método proposto apresenta precisões intraensaios e interensaios conformes e é um bom candidato a método alternativo ao ensaio murino, tanto para a determinação da potência do veneno botrópico quanto do soro antibotrópico. |
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Nundes, Renata Norbert CostaAraujo, Humberto Pinheiro deZamith, Helena Pereira da SilvaGonzález, Marcelo SalabertMoura, Wlamir Corrêa deAlmeida, Antonio Eugenio Castro Cardoso de2019-09-16T19:39:03Z2019-09-16T19:39:03Z2017NUNDES, R. N. C. Pré-validação do ensaio de potência in vitro para veneno botrópico e soro antibotrópico. 2017. 107 f. Dissertação (Mestrado Profissional em Vigilância Sanitária) – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35613Acidentes com animais peçonhentos são a segunda causa de intoxicação em humanos no Brasil. Na América Central e do Sul a incidência destes acidentes é predominantemente por serpentes do gênero Bothrops. No Brasil em 2015 foram notificados 24.467 acidentes dentre os quais 73,5% causados pelo gênero Bothrops. 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Um método alternativo validado deve passar por todas as fases de desenvolvimento, pré-validação, validação e revisão por especialistas conferindo credibilidade através dos Centros de Validações. A pré-validação é importante antes da realização de um estudo formal de validação em larga escala, deve envolver a otimização e padronização do protocolo, a identificação de qualquer problema inesperado, incluindo aqueles relacionados à análise dos resultados, bem como uma avaliação inicial da transferibilidade interlaboratorial do método. Este estudo pretende pré-validar uma metodologia mais eficiente do que a recomendada atualmente e que é mais rápida, visando reduzir o custo através da redução de insumos, materiais utilizados e tempo para liberar lotes de veneno e antiveneno. O método proposto é capaz de quantificar o efeito citotóxico de metaloproteases e fosfolipases A2, principais toxinas presentes no veneno de B. jararaca. A potência in vitro do Veneno Botrópico de Referência foi de 4,18 μg/mL e para o Soro Antibotrópico de Referência foi de 0,126 μl / mL. O ensaio de potência do Veneno Botrópico teve o coeficiente de variação geométrico (gCV) interensaios de 27,79% e o gCV intraensaios de 14,76%. Para a potência do Soro Antibotrópico de Referência o resultado obtido de gCV intraensaio foi 7,52% e o gCV interensaio foi 7,59%. O método apresentou linearidade válida (p>0,05) para todos os ensaios. Os resultados obtidos demonstram que o método proposto apresenta precisões intraensaios e interensaios conformes e é um bom candidato a método alternativo ao ensaio murino, tanto para a determinação da potência do veneno botrópico quanto do soro antibotrópico.Accidents with venomous animals are the second cause of human intoxication in Brazil. In Central and South America the incidence of these accidents is predominantly by Bothrops snakes. In Brazil in 2015, 24,467 accidents were reported, of which 73.5% were caused by the genus Bothrops. In the Instituto Nacional de Controle de Qualidade (INCQS) approximately 5,500 mice are used per year only for the bothropic and crotalic antivenom potency assay, therefore it is very important to develop an alternative method to the use of animals. INCQS has a group of researchers engaged in the search for alternative methods to animal use since 1999.The principle of the proposed technique is based on the property of the bothropic venom to induce cytotoxicity effect in monkey kidney Vero cells and its inhibition by the antivenom. The concentration of adhered cells can be evaluated by staining and subsequent elution of the dye, the optical density of the dye eluate is directly proportional to the concentration of living cells. A validated alternative method must go through all phases of development, prevalidation, validation and review by experts, conferring credibility through the Validation Centers. Pre-validation is important prior to conducting a formal validation study on a large scale, it should involve any optimization and standardization in the protocol, the identification of any unexpected problem including those related to the analysis of the results, as well as an initial assessment of the Interlaboratorial transferability of the method. This study aims to pre-validate a methodology that is more efficient than currently recommended and that is faster, aiming at reducing the cost through the reduction of inputs, materials used and time to release lots of venom and antivenom. The proposed method is able to quantify the cytotoxic effect of metalloproteases and phospholipases A2, the main toxins present in B. jararaca venom. The determined potency in vitro for the Brazilian Bothrops Reference Venom was 4,18 µg/mL, and for the Brazilian Bothropic Reference Antivenom was 0,126 µl/mL. For the potency evaluation of Bothrops Reference Venom the inter-assay geometric Coefficient of Variation (gCV) was 27,79% and the gCV intra-assay of 14.76%. The intra-assay precision of potency in vitro for Bothrops Reference Antivenom determinations was 7.52% and the gCV inter-assay was 7.59%. The method presented valid linearity (p> 0.05) for all assays. The results obtained demonstrate that the proposed method intra-assay and inter-assay precisions were according and it is a good candidate for an alternative method to the murine assay, both for the determination of the potency of the bothropic venom and of the bothropic antivenom.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porVeneno BotrópicoSoro AntibotrópicoEnsaio de citotoxicidadeMétodo alternativoPré-validaçãoBothropic VenomBothropic AntivenomCytotoxicity AssayAlternative MethodPre-ValidationBothropsVenenos de SerpentesAntivenenosTestes Imunológicos de CitotoxicidadeAlternativas aos Testes com AnimaisPré-validação do ensaio de potência in vitro para veneno botrópico e soro antibotrópicoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2017Coordenação de Pós GraduaçãoFundação Oswaldo Cruz. 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