Impacto de métodos de preservação na caracterização por taxonomia polifásica de isolados de sporothrix spp

• Autor(a) principal: Rabello, Vanessa Brito de Souza
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/37305
• topic: Preservação; Sporothrix spp.; Fenótipo; Genótipo; Sporothrix; Fungos Mitospóricos; Preservação biológica; Preservação de amostras; Fenotipo; Genotipo; Proteômica

Os métodos de preservação empregados em micologia buscam manter a viabilidade e a estabilidade das características fenotípicas e genéticas. Entretanto, alterações podem ocorrer dependendo da metodologia empregada. Atualmente são escassos os dados da estabilidade dos isolados de Sporothrix spp., incluindo perfis fenotípicos, genotípicos e proteômicos após o armazenamento. Com a recente descrição das novas espécies patogênicas, para o homem e outros mamíferos, torna-se necessário o armazenamento desses fungos em coleções de culturas para estudos futuros, possibilitando maior conhecimento sobre a taxonomia, fisiologia e virulência de Sporothrix spp. Portanto, o objetivo desse estudo foi avaliar métodos de preservação que permitam manter a estabilidade dos perfis fenotípicos, genotípicos e proteômicos dos isolados de Sporothrix spp.. Com esse propósito foram utilizados 8 isolados de Sporotrix spp., armazenados por três diferentes métodos. Preservação em água destilada, sob refrigeração a 4ºC e criopreservação a -80°C, por períodos de 6, 12, 18 e 24 meses de armazenamento. Os isolados foram identificados pelo sequenciamento parcial dos genes calmodulina e \03B2-tubulina e pela PCR fingerprinting. A estabilidade do fenótipo foi realizada, por meio das provas fenotípicas sugeridas na chave de identificação das espécies de Sporothrix spp. que incluem: morfologia dos conídios, diâmetro da colônia a 30°C, teste de termotolerância a 37°C e assimilação de carboidratos, glicose sacarose e rafinose. O dimorfismo também foi avaliado após a preservação. A estabilidade genotípica foi realizada por meio do sequenciamento parcial do gene codificador da \03B2-tubulina A estabilidade proteômica foi realizada por espectrometria de massa (MALDI-TOF MS), após 24 meses de preservação. Todos os isolados foram recuperados dos três métodos em todos os períodos avaliados. No entanto, os isolados preservados em água destilada apresentaram contaminações. Alterações morfológicas foram observadas após preservação a -80°C, um isolado deixou de apresentar colônia pigmentada e conídios demáceos. O diâmetro das colônias assim como a termotolerância permaneceram estáveis nos três métodos. A principal alteração ocorreu com o perfil de assimilação de carboidratos e essa variação modificou a identificação das espécies pela chave taxonômica. A estabilidade genotípica para o gene codificador da \03B2-tubulina foi preservada após 24 meses em ambos os métodos de armazenamento. Entretanto, baixo polimorfismo foi detectado após preservação em água destilada. Os isolados foram identificados corretamente por espectometria de massa após o armazenamento, porém alterações no perfil protéico foram observadas. O método de preservação a 4°C foi o mais efetivo para preservar os isolados de Sporothrix spp., manteve estável a maioria das características fenotípicas, como também a estabilidade do genótipo por até 24 meses de armazenamento. Esse é um método simples e de baixo custo que pode seu usado em laboratórios de recursos limitados como, um método alternativo de preservação.