Combinação de Captura Dirigida e PCR na Detecção de Flebotomíneos Naturalmente Infectados por Leishmanias

• Autor(a) principal: Miranda, José Carlos
• Data de Publicação: 1998
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33574
• topic: Psychodidae; Lutzomyia whitmani; Lutzomyia intermedia; Leishmania braziliensis; Reação em cadeia por polimerase; Biologia molecular; Psychodidae; Lutzomyia whitmani; Lutzomyia intermedia; Leishmania braziliensis; Polymerase chain reaction; Molecular biology

Os relatos sobre índice de infecção natural de flebótomos, por promastigotas de leishmania, em focos endêmicos de Leishmaniose Tegumentar Americana variam de 0 a 1,19%, o que, aparentemente não justifica a alta transmissão da doença. Na maioria das vezes, a técnica utilizada para detectar a infecção do flebótomo, é baseada na dissecção e exame do aparelho digestivo desses dípteros. Quando a captura foi direcionada para próximo de uma casa com um caso humano de infecção recente (mais ou menos 15 dias), foi encontrado 1 flebótomo positivo em 193 examinados. Decidimos então, utilizar a Reação de Polimerase em Cadeia para detecção de leishmania em flebotomíneos capturados no domicílio e peridomicílio, de casos recentes de leishmanioses, para avaliar a infecção natural de flebotomíneos, na área endêmica de Corte de Pedra, Bahia. Coletamos 4.027 fêmeas de flebotomíneos em 79 capturas e agrupamos em 335 amostras (10 ou 20 flebótomos por amostra). As amostras foram acondicionadas em criotubos e conservadas em nitrogênio líquido até a extração do DNA. Para as Reações de Polimerase em Cadeia, foram utilizados oligonucleotídeos que amplificam a região conservada da molécula do minicírculo da leishmania: 5 GGG G/TAG GGG CTG TCT GCG AA 3 e 5 GGC CCA CTA TAT ACC CCC 3 e 5 CCG CCC CTA TTA TAC ACC AAC CCC 3 . A sensibilidade da técnica de PCR para a detecção de leishmania foi avaliada testando culturas com 10, 100 e 1000 leishmania misturadas com 10 ou 20 flebótomos em cada tubo. O produto amplificado foi submetido a eletroforese em gel de agarose, corado pelo brometo de etidio, visualizado sob luz ultra violeta, e foi possível hibridizar com sondas para os subgeneros Viannia e Leishmania. Nós conseguimos detectar DNA de leishmania, em amostras, contendo aproximadamente, 10 parasitos com 10 ou 20 flebótomos. Os resultados obtidos em gel de agarose, mostraram 11 amostras positivas. Após a hibridização foram observadas um total de 30 amostras positivas (incluindo as 11 positivas no exame pela ultra violeta). Na hibridização, foram utilizadas sondas que correspondiam a moléculas clonadas dos segmentos do minicírculo de Leishmania (Viannia) panamensis, IPAN V, número de acesso no Gene Bank U19811 e Leishmania (Leishmania) amazonensis, MHOM/BR/73 M2269, número de acesso no Gene Bank U198/0. Na área do estudo ocorre a Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis. Considerando que em cada amostra positiva continha apenas um exemplar infectado, a proporção de flebótomos infectados foi 0.74% quando comparada ao número total de flebótomos examinados e 8,95% quando relacionada aos grupos de flebótomos. Esses resultados mostram que o uso da Reação de Polimerase em Cadeia em amostras coletadas próximas a casas de pacientes recentemente diagnosticados para leishmanioses, melhora a detecção de flebotomíneos infectados por leishmania, em áreas endêmicas e pode ser uma ferramenta útil para avaliar o padrão de infecção por leishmania.