Metagenômica como ferramenta diagnóstica e identificação de patógenos emergentes

• Autor(a) principal: Nascimento, Alessandra Gonzalez do
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/60571
• topic: Metagenômica; Sequenciamento de nova geração; Viroma; Sequenciamento por nanoporos; Protocolo de validação; Metagenomics; Next generation sequencing; Virome; Nanopore sequencing; Validation protocol; Metagenômica; Sequenciamento de Nova Geração; Protocolos

INTRODUÇÃO: A análise metagenômica de dados de tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) tem fornecido oportunidades para o diagnóstico e vigilância em saúde pública de patógenos conhecidos e ou emergentes em amostras clínicas. OBJETIVO: Neste trabalho objetivou-se padronizar e validar um método de sequenciamento de nova geração (NGS) para análise metagenômica viral utilizando o MinION. MATERIAL E MÉTODOS: Dados de treinamento foram utilizados em benchmarks, para testar os diferentes workflows (wf) de bioinformática e otimizar o tempo de processamento das análises de reconhecimento das bases (basecalling) e demultiplexação. A principal diferença entre os wfs consistiu no software utilizado para classificação taxonômica sendo: primariamente, utilizamos o Kraken2 no wf1, que classifica vírus e bactérias a partir de um grande banco de dados; e o BLAST no wf2, que utiliza um banco local apenas com sequencias de referência virais de interesse (painel); e, alternativamente, utilizamos o Genome Detective no wf3, que é uma ferramenta web para análise de sequencias virais; e, por fim, o Epi2ME no wf4, para uma análise rápida e automatizada. Um ensaio de diluição seriada utilizando a vacina de poliovírus atenuados (OPV) foi realizado para testar o limiar de detecção dos nossos métodos. Amostras clínicas retrospectivas e recentes de arboviroses, casos suspeitos de meningites virais, infecções agudas do trato respiratório e infecções crônicas causadas por hepatites virais e HIV, além de amostras de isolados virais foram testadas. O RNA viral foi enriquecido pela depleção do DNA por DNAses. O cDNA foi sintetizado por transcrição reversa e amplificado por SISPA antes da preparação das bibliotecas e sequenciamento num dispositivo portátil MinION (ONT). Uma análise de acurácia foi realizada utilizando-se diferentes cut-off (0,0% a 5,0%) da abundância relativa em nível de reads e contigs classificadas para eliminar “ruídos” ou artefatos do sequenciamento. RESULTADOS: O basecalling para o modelo fast foi otimizado, 1,36 horas, e para o modelo hac, 30,72 horas, que representa redução de 10% e 81%, respectivamente, no tempo médio de processamento dos dados de treinamento. Entretanto, o modelo fast foi preferido por ter melhor relação do custo computacional e acurácia. Foi possível identificar os enterovírus presentes na OPV até a diluição de 10-4 tanto pelo wf1 quanto pelo wf2. Ao todo, seis bibliotecas foram preparadas contendo 35 amostras clínicas com suspeita de infecção por vírus RNA. Tanto em nível de reads quanto contigs, o wf3 apresentou a melhor acurácia (70%) e (67%), respectivamente, utilizando um cut-off ≥ 1,0%. O wf4 não disponibiliza as reads classificadas para montagem e análise em nível de contigs. CONCLUSÕES: Os resultados deste estudo demonstram que a utilização de uma metodologia de NGS metagenômica possibilita o diagnóstico acurado de patógenos virais de importância clínica. O MinION foi capaz de realizar a análise do viroma e diagnóstico de infecções virais com acurácia. Avanços nessa metodologia podem reduzir custos e poderão possibilitar viabilizar sua utilização na rotina de diagnóstico, com a vantagem de permitir a vigilância e descoberta de agentes emergentes