Influence of mini-Percoll techniques in sperm capacitation and plasma membrane integrity of ram frozen-thawed sperm.

• Autor(a) principal: OLIVARES, C. C. S.
• Data de Publicação: 2016
• Outros Autores: ALFRADIQUE, V. A. P., SOUZA FABJAN, J. M. G., FONSECA, J. F. da, SARAIVA, H. F. R. A., CÔRTES, L. R., COSTA, L. C. da, BRANDÃO, F. Z.
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Institucional da EMBRAPA (Repository Open Access to Scientific Information from EMBRAPA - Alice)
• Texto Completo: http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/1052416
• topic: Sperm selection; Sperm preparation; Mini-Percoll; Ovino; Ovelha; Reprodução animal; Espermatozóide; Sêmen; Sheep; Spermatozoa

Abstract: The success of IVF and subsequent development of embryos are directly related to sperm selection and quality. This study aimed to evaluate the effect of different forces and time of centrifugation in mini-Percoll (MP) techniques for sperm selection on capacitation status and plasma membrane (PM) integrity of ram frozen-thawed sperm. Commercial semen from 10 rams of Santa Inês breed, aging 2-5 years old, were used. At post-thawing (PT), the PM integrity was evaluated by CASA using the SCA® system (Sperm Class Analyzer ? Microptic Automatic Diagnostic Systems, Barcelona, Spain). For traditional Percoll (Sigma Chemical, St. Louis, USA), a 2 mL-gradient (90/45% density) was subjected to a 700 x g centrifugation for 10 min followed by 200 x g for 5 min. The MP techniques consisted in an 800 µL-gradient (90/45% density) subjected to either: I) two centrifugations of 5000 x g for 5 min; II) two centrifugations of 2500 x g for 5 min; III) two centrifugations of 1250 x g for 5 min; IV) 700 x g for 10 min, followed by 200 x g for 5 min. At the end of all treatments, aliquots (post-protocols = 0 h) were taken for evaluation of PM integrity and capacitation status by chlortetracycline stain (Sigma Chemical, St. Louis, USA). Later on, samples of all treatments were submitted to incubation at 37°C, 1 h, 2 h and 3 h and the same parameters were assessed. The variables were subjected to either ANOVA or Kruskal-Wallis tests depending on normality, Tukey and Fisher-LSD analysis (P < 0.05). There was no difference (P > 0.05) among all treatments for capacitation status and PM integrity. The capacitated rate was higher (P < 0.05) at 3 h (28.6 ± 2.5%) when compared with 0 h (23.3 ± 1.7%) and 1 h (23.8 ± 1.4%) of incubation, regardless of the treatment. There was no difference (P > 0.05) for PM integrity among the protocols at 0h. Regardless of the treatment, the intact and damaged PM rate, respectively, were similar (P > 0.05) for PT (16.4 ± 2.0% vs. 84.0 ± 2.0%) and 0 h (19.0 ± 2.9% vs. 81.1 ± 2.9%; average of all treatments). When analyzing just intact cells, the PT values were greater (P < 0.05) than any incubation interval, whereas the latter were lower than 0 h values (P < 0.05). In conclusion, MP may be used as an ideal alternative to the traditional Percoll, decreasing costs and time of sperm handling, without cell damages in ram sperm. Chemical, St. Louis, USA). [Influência de diferentes técnicas de mini-percoll na capacitação espermática e integridade de membrana plasmática de sêmen descongelado de carneiros]. Resumo: O sucesso da FIV e posterior desenvolvimento embrionário são diretamente relacionados com a qualidade seminal e seleção espermática. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes forças e tempo de centrifugação de diferentes técnicas de seleção espermática de mini-Percoll (MP) no status da capacitação espermática e integridade da membrana plasmática (MP) de sêmen descongelado de carneiros. Foram utilizadas 10 palhetas de sêmen comercial congelado de diferentes carneiros da raça Santa Inês, com idade entre 2-5 anos. Na avaliação pós descongelamento (PD), a integridade de MP foi analisada pelo CASA por meio do sistema SCA® (Sperm Class Analyzer ? Microptic Automatic Diagnostic Systems, Barcelona, Espanha). A técnica de Percoll (Sigma Chemical, St. Louis, USA) tradicional consistiu em utilizar 2 mL de gradiente (90/45%) e centrifugar a uma força de 700 x g por 10 minutos, seguida de outra centrifugação a 200 x g por 5 minutos. As técnicas de MP consistiram em utilizar um volume de 800 ?L de gradiente (90/45%) que foram submetidos aos seguintes tempos e forças de centrifugação: I) duas centrifugações de 5000 x g por 5 minutos; II) duas centrifugações de 2500 x g por 5 minutos; III) duas centrifugações de1250 x g por 5 minutos; IV) 700 x g por 10 minutos, seguidas de outra centrifugação a 200 x g por 5 minutos. No fim dos tratamentos (pós protocolos = 0 h), alíquotas foram retiradas para avaliação da integridade de MP e status da capacitação espermática pela coloração de clortetraciclina (Sigma Chemical, St. Louis, USA). Posteriormente, as amostras de todos os tratamentos foram incubadas a 37 °C, 1 h, 2 h e 3 h e os mesmos parâmetros foram avaliados. As variáveis foram submetidas às análises de ANOVA ou teste de Kruskal-Wallis dependendo da normalidade, e testes de Tukey e Fisher-LSD (P < 0,05). Não houve diferença (P > 0,05) entre os tratamentos durante a avaliação do status da capacitação espermática e da integridade de MP. A taxa de capacitação foi maior (P < 0.05) em 3 h de incubação (28,6 ± 2,5%) quando comparado com 0 h (23,3 ± 1,7%) e 1 h (23,8 ± 1,4%), independente do tratamento utilizado. Não houve diferença (P > 0,05) em relação à integridade de MP entre os tratamentos a 0 h. Independente do tratamento utilizado, as taxas de MP íntegra e lesada, respectivamente, foram semelhantes (P > 0,05) no PD (16,4 ± 2,0% vs. 84,0 ± 2,0%; média de todos os tratamentos) e no momento 0 h (19,0 ± 2,9% vs. 81,1 ± 2,9%; média de todos os tratamentos). Quando foram analisadas somente células íntegras, os valores no PD foram maiores (P < 0,05) do que todos os intervalos de incubação, enquanto que todos os intervalos de incubação apresentaram taxas menores que os valores encontrados no momento 0 h (P < 0,05). Em conclusão, as técnicas de MP podem ser utilizadas como uma alternativa ideal ao método tradicional de Percoll durante a seleção espermática de sêmen congelado de carneiros, diminuindo custos e tempo de preparação espermática, sem que haja danos aos espermatozoides.