Clonagem de serino proteases do veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus e express??o da giroxina em c??lula de mam??fero

• Autor(a) principal: YONAMINE, CAMILA M.
• Data de Publicação: 2007
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11593
• topic: snakes; venoms; enzymes; serine proteinases; cloning; trypsin; thrombin; escherichia coli; animal cells; mammary glands

As serino proteases participam de diversos processos fisiol??gicos (tal como o de coagula????o) e patol??gicos. Essas enzimas est??o amplamente distribu??das entre as esp??cies, s??o tamb??m toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs s??o multifuncionais e cont??m uma tr??ade catal??tica formada pelos amino??cidos HDS. Algumas SVSPs s??o comercialmente dispon??veis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do mioc??rdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus est??o descritas at?? o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada ?? a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de gl??ndula de veneno de um ??nico esp??cime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com rela????o ?? organiza????o do cDNA, estrutura e prov??veis fun????es. A constru????o do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosila????o e a presen??a de muitas pontes dissulfetos dificultam a obten????o das SVSP recombinantes na forma sol??vel e com atividade, por express??o em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a express??o em c??lulas de mam??fero (que realiza as modifica????es p??s-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o pept??deo sinal de Igk, a seq????ncia madura e a regi??o 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o pept??deo sinal de Igk, o que possibilitou a secre????o da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em c??lulas CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das c??lulas COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade ester??sica.