Síntese de corantes esquarílicos para cromatografia de afinidade de biomoléculas
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2015 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10348/4538 |
Resumo: | A Cromatografia de Afinidade (CA) é uma das mais importantes técnicas de separação e purificação de biomoléculas, sendo a mais específica das atualmente disponíveis. Baseia-se no reconhecimento bioespecífico entre a molécula alvo e um ligando imobilizado numa matriz. Nos últimos anos, a CA tem-se tornado usual para a purificação de proteínas, uma vez que se baseia numa interação específica reversível única entre a proteína e um ligando. Nesta interação de afinidade, a escolha do ligando é extremamente importante no sucesso do protocolo de purificação. O crescente interesse pela CA tem motivado intenso esforço de investigação no sentido do desenvolvimento de materiais capazes de superar as desvantagens dos ligandos naturais convencionais, nomeadamente o elevado custo e a labilidade química e biológica. Neste contexto, os corantes sintéticos surgiram, nas últimas décadas, como uma promissora alternativa aos ligandos biológicos. Embora a CA com corantes tenha vindo a ser intensamente investigada, a utilização de cianinas como ligandos é praticamente desconhecida. O principal objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de novos suportes cromatográficos com corantes esquarílicos cianínicos como ligandos capazes de promover interações seletivas com biomoléculas de interesse. Para tal, foram sintetizados vários corantes aminoesquarílicos simétricos com grupos terminais derivados do benzoselenazole, benzotiazole e quinolina, possuindo grupos pendentes N-alquilo de diferentes comprimentos. O anel central de quatro membros de cada corante foi funcionalizado com braços espaçadores de diferente extensão, possuindo um grupo amina terminal para possibilitar a respetiva ligação à matriz cromatográfica. Os vários corantes sintetizados foram posteriormente imobilizados em agarose (Sepharose CL-6B), em diferentes concentrações, usando como agentes de ativação 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano e cloreto de cianurilo. Foram igualmente sintetizados vários corantes esquarílicos assimétricos, derivados do benzotiazole, possuindo um grupo pendente N-alquilo num dos heterociclos terminais e um grupo N-carboxietilo no outro, sendo este último usado para ligação à matriz (Sepharose CL- -6B). Neste caso, os corantes foram imobilizados, via amidação, em agarose previamente ativada com diferentes aminas. Os compostos novos sintetizados foram caraterizados estruturalmente por espectroscopia de UV/Vis, de IV, de RMN de 1H e de 13C e de Massa de Alta ou Baixa resolução. Os suportes cromatográficos obtidos, quando justificado, foram ainda caraterizados por Análise Elementar. Alguns dos suportes cromatográficos foram testados na separação de proteínas no Laboratório de Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior. O suporte contendo um corante aminoesquarílico simétrico derivado do benzotiazole, possuindo cadeias N-hexilo e uma baixa densidade de ligando, permitiu a separação de uma mistura de lisozima, tripsina e α-quimotripsina. A comparação com um suporte de controlo permite atribuir a eficácia da separação ao corante imobilizado. Sepharose ativada com diaminodipropilamina permitiu a separação eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e K-Caseína. Unidades de diaminodipropilamina acilada parecem ser as principais responsáveis pela separação. Sepharose ativada com etilenodiamina permitiu uma separação muito eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e lisozima, parecendo ser proporcionada por estruturas resultantes da ciclização de duas unidades de etilenodiamina, com inclusão de um resíduo de NHS, via rearranjo de Lossen do ácido hidroxâmico intermediário. |
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O crescente interesse pela CA tem motivado intenso esforço de investigação no sentido do desenvolvimento de materiais capazes de superar as desvantagens dos ligandos naturais convencionais, nomeadamente o elevado custo e a labilidade química e biológica. Neste contexto, os corantes sintéticos surgiram, nas últimas décadas, como uma promissora alternativa aos ligandos biológicos. Embora a CA com corantes tenha vindo a ser intensamente investigada, a utilização de cianinas como ligandos é praticamente desconhecida. O principal objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de novos suportes cromatográficos com corantes esquarílicos cianínicos como ligandos capazes de promover interações seletivas com biomoléculas de interesse. Para tal, foram sintetizados vários corantes aminoesquarílicos simétricos com grupos terminais derivados do benzoselenazole, benzotiazole e quinolina, possuindo grupos pendentes N-alquilo de diferentes comprimentos. O anel central de quatro membros de cada corante foi funcionalizado com braços espaçadores de diferente extensão, possuindo um grupo amina terminal para possibilitar a respetiva ligação à matriz cromatográfica. Os vários corantes sintetizados foram posteriormente imobilizados em agarose (Sepharose CL-6B), em diferentes concentrações, usando como agentes de ativação 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano e cloreto de cianurilo. Foram igualmente sintetizados vários corantes esquarílicos assimétricos, derivados do benzotiazole, possuindo um grupo pendente N-alquilo num dos heterociclos terminais e um grupo N-carboxietilo no outro, sendo este último usado para ligação à matriz (Sepharose CL- -6B). Neste caso, os corantes foram imobilizados, via amidação, em agarose previamente ativada com diferentes aminas. Os compostos novos sintetizados foram caraterizados estruturalmente por espectroscopia de UV/Vis, de IV, de RMN de 1H e de 13C e de Massa de Alta ou Baixa resolução. Os suportes cromatográficos obtidos, quando justificado, foram ainda caraterizados por Análise Elementar. Alguns dos suportes cromatográficos foram testados na separação de proteínas no Laboratório de Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior. O suporte contendo um corante aminoesquarílico simétrico derivado do benzotiazole, possuindo cadeias N-hexilo e uma baixa densidade de ligando, permitiu a separação de uma mistura de lisozima, tripsina e α-quimotripsina. A comparação com um suporte de controlo permite atribuir a eficácia da separação ao corante imobilizado. Sepharose ativada com diaminodipropilamina permitiu a separação eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e K-Caseína. Unidades de diaminodipropilamina acilada parecem ser as principais responsáveis pela separação. Sepharose ativada com etilenodiamina permitiu uma separação muito eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e lisozima, parecendo ser proporcionada por estruturas resultantes da ciclização de duas unidades de etilenodiamina, com inclusão de um resíduo de NHS, via rearranjo de Lossen do ácido hidroxâmico intermediário.Affinity Chromatography (AC) is one of the most important techniques for the separation and purification of biomolecules, being the most specific one currently available. It is based on the biospecific recognition between the target molecule and a ligand immobilized on a matrix. In recent years, AC has become usual for protein purification, since it is based on an unique specific reversible interaction between the protein and a ligand. In this affinity interaction, the choice of the ligand is extremely important to the success of the purification protocol. The growing interest in AC has motivated an intense research effort towards the development of materials able to overcome the disadvantages of conventional natural ligands, namely the high cost and chemical and biological lability. In this context, synthetic dyes have emerged, in recent decades, as a promising alternative to biological ligands. Although dye-AC has been intensively investigated, the use of cyanines as ligands is virtually unknown. The main objective of this work was the development of new chromatographic supports with squarylium cyanine dyes as ligands capable of promoting selective interactions with biomolecules of interest. For this purpose, several symmetrical aminosquarylium dyes bearing terminal groups derived from benzoselenazole, benzothiazole and quinoline and having pendant N-alkyl groups of different length were synthesized. The central four-member ring of each dye was functionalized with spacer arms of different extension, possessing a terminal amino group to allow binding to the chromatographic matrix. The various dyes synthesized were subsequently immobilized on agarose (Sepharose CL-6B), at different concentrations, using as activating agents 1,4-bis(2,3-epoxypropoxy)butane and cyanuric chloride. Several unsymmetric squarylium dyes derived from benzothiazole, bearing a pendant N-alkyl group on one of the ending heterocyclic nucleus and a N-carboxyethyl group on the other, the latter being used to link to agarose (Sepharose CL-6B), were also synthesized. In this case, the dyes were immobilized, via amidation, on agarose previously activated with different amines. The new synthesized compounds were structurally characterized by UV/Vis, IR, 1H and 13C NMR and High or Low Resolution Mass spectroscopy. The chromatographic supports obtained, when justified, were additionally characterized by Elemental Analysis. Some of the prepared chromatographic supports were tested in the separation of proteins at the Laboratório de Cromatografia of the Centro de Investigação em Ciências da Saúde of the Universidade da Beira Interior. The support containing a symmetrical aminosquarylium dye derived from benzothiazole bearing N-hexyl groups and a low ligand density allowed the separation of a mixture of lysozyme, trypsin and α-chymotrypsin. Comparison with a control support attributed the separation ability to the immobilized dye. Sepharose activated with diaminodipropylamine allowed an efficient separation of a mixture of BSA, RNase A and K-Casein. Acylated diaminodipropylamine units seem to be the main responsible for the separation. Sepharose activated with ethylenediamine allowed a very efficient separation of a mixture of BSA, lysozyme and RNase A. In this case the separation seems to be provided by structures resulting from the cyclization of two units of ethylenediamine with inclusion of an NHS residue, via Lossen rearrangement of an intermediate hydroxamic acid.2015-05-04T15:08:07Z2015-05-04T00:00:00Z2015-05-04info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10348/4538porGraça, Vânia Cristina Santos Sena dainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-02-02T12:36:06Zoai:repositorio.utad.pt:10348/4538Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T02:01:22.493901Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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A Cromatografia de Afinidade (CA) é uma das mais importantes técnicas de separação e purificação de biomoléculas, sendo a mais específica das atualmente disponíveis. Baseia-se no reconhecimento bioespecífico entre a molécula alvo e um ligando imobilizado numa matriz. Nos últimos anos, a CA tem-se tornado usual para a purificação de proteínas, uma vez que se baseia numa interação específica reversível única entre a proteína e um ligando. Nesta interação de afinidade, a escolha do ligando é extremamente importante no sucesso do protocolo de purificação. O crescente interesse pela CA tem motivado intenso esforço de investigação no sentido do desenvolvimento de materiais capazes de superar as desvantagens dos ligandos naturais convencionais, nomeadamente o elevado custo e a labilidade química e biológica. Neste contexto, os corantes sintéticos surgiram, nas últimas décadas, como uma promissora alternativa aos ligandos biológicos. Embora a CA com corantes tenha vindo a ser intensamente investigada, a utilização de cianinas como ligandos é praticamente desconhecida. O principal objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de novos suportes cromatográficos com corantes esquarílicos cianínicos como ligandos capazes de promover interações seletivas com biomoléculas de interesse. Para tal, foram sintetizados vários corantes aminoesquarílicos simétricos com grupos terminais derivados do benzoselenazole, benzotiazole e quinolina, possuindo grupos pendentes N-alquilo de diferentes comprimentos. O anel central de quatro membros de cada corante foi funcionalizado com braços espaçadores de diferente extensão, possuindo um grupo amina terminal para possibilitar a respetiva ligação à matriz cromatográfica. Os vários corantes sintetizados foram posteriormente imobilizados em agarose (Sepharose CL-6B), em diferentes concentrações, usando como agentes de ativação 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano e cloreto de cianurilo. Foram igualmente sintetizados vários corantes esquarílicos assimétricos, derivados do benzotiazole, possuindo um grupo pendente N-alquilo num dos heterociclos terminais e um grupo N-carboxietilo no outro, sendo este último usado para ligação à matriz (Sepharose CL- -6B). Neste caso, os corantes foram imobilizados, via amidação, em agarose previamente ativada com diferentes aminas. Os compostos novos sintetizados foram caraterizados estruturalmente por espectroscopia de UV/Vis, de IV, de RMN de 1H e de 13C e de Massa de Alta ou Baixa resolução. Os suportes cromatográficos obtidos, quando justificado, foram ainda caraterizados por Análise Elementar. Alguns dos suportes cromatográficos foram testados na separação de proteínas no Laboratório de Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior. O suporte contendo um corante aminoesquarílico simétrico derivado do benzotiazole, possuindo cadeias N-hexilo e uma baixa densidade de ligando, permitiu a separação de uma mistura de lisozima, tripsina e α-quimotripsina. A comparação com um suporte de controlo permite atribuir a eficácia da separação ao corante imobilizado. Sepharose ativada com diaminodipropilamina permitiu a separação eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e K-Caseína. Unidades de diaminodipropilamina acilada parecem ser as principais responsáveis pela separação. Sepharose ativada com etilenodiamina permitiu uma separação muito eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e lisozima, parecendo ser proporcionada por estruturas resultantes da ciclização de duas unidades de etilenodiamina, com inclusão de um resíduo de NHS, via rearranjo de Lossen do ácido hidroxâmico intermediário. |
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