Síntese de corantes esquarílicos para cromatografia de afinidade de biomoléculas

• Autor(a) principal: Graça, Vânia Cristina Santos Sena da
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/4538
• topic: Bioquímica; Cromatografia de afinidade; Purificação de biomoléculas; Corantes aminoesquarílicos simétricos; Corantes esquarílicos assimétricos

A Cromatografia de Afinidade (CA) é uma das mais importantes técnicas de separação e purificação de biomoléculas, sendo a mais específica das atualmente disponíveis. Baseia-se no reconhecimento bioespecífico entre a molécula alvo e um ligando imobilizado numa matriz. Nos últimos anos, a CA tem-se tornado usual para a purificação de proteínas, uma vez que se baseia numa interação específica reversível única entre a proteína e um ligando. Nesta interação de afinidade, a escolha do ligando é extremamente importante no sucesso do protocolo de purificação. O crescente interesse pela CA tem motivado intenso esforço de investigação no sentido do desenvolvimento de materiais capazes de superar as desvantagens dos ligandos naturais convencionais, nomeadamente o elevado custo e a labilidade química e biológica. Neste contexto, os corantes sintéticos surgiram, nas últimas décadas, como uma promissora alternativa aos ligandos biológicos. Embora a CA com corantes tenha vindo a ser intensamente investigada, a utilização de cianinas como ligandos é praticamente desconhecida. O principal objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de novos suportes cromatográficos com corantes esquarílicos cianínicos como ligandos capazes de promover interações seletivas com biomoléculas de interesse. Para tal, foram sintetizados vários corantes aminoesquarílicos simétricos com grupos terminais derivados do benzoselenazole, benzotiazole e quinolina, possuindo grupos pendentes N-alquilo de diferentes comprimentos. O anel central de quatro membros de cada corante foi funcionalizado com braços espaçadores de diferente extensão, possuindo um grupo amina terminal para possibilitar a respetiva ligação à matriz cromatográfica. Os vários corantes sintetizados foram posteriormente imobilizados em agarose (Sepharose CL-6B), em diferentes concentrações, usando como agentes de ativação 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano e cloreto de cianurilo. Foram igualmente sintetizados vários corantes esquarílicos assimétricos, derivados do benzotiazole, possuindo um grupo pendente N-alquilo num dos heterociclos terminais e um grupo N-carboxietilo no outro, sendo este último usado para ligação à matriz (Sepharose CL- -6B). Neste caso, os corantes foram imobilizados, via amidação, em agarose previamente ativada com diferentes aminas. Os compostos novos sintetizados foram caraterizados estruturalmente por espectroscopia de UV/Vis, de IV, de RMN de 1H e de 13C e de Massa de Alta ou Baixa resolução. Os suportes cromatográficos obtidos, quando justificado, foram ainda caraterizados por Análise Elementar. Alguns dos suportes cromatográficos foram testados na separação de proteínas no Laboratório de Cromatografia do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior. O suporte contendo um corante aminoesquarílico simétrico derivado do benzotiazole, possuindo cadeias N-hexilo e uma baixa densidade de ligando, permitiu a separação de uma mistura de lisozima, tripsina e α-quimotripsina. A comparação com um suporte de controlo permite atribuir a eficácia da separação ao corante imobilizado. Sepharose ativada com diaminodipropilamina permitiu a separação eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e K-Caseína. Unidades de diaminodipropilamina acilada parecem ser as principais responsáveis pela separação. Sepharose ativada com etilenodiamina permitiu uma separação muito eficiente de uma mistura de BSA, RNase A e lisozima, parecendo ser proporcionada por estruturas resultantes da ciclização de duas unidades de etilenodiamina, com inclusão de um resíduo de NHS, via rearranjo de Lossen do ácido hidroxâmico intermediário.