Targeting miR-124 in motor neurons as a therapeutic strategy to prevent neurodegeneration and glial activations in ALS
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/39295 |
Resumo: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018 |
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Targeting miR-124 in motor neurons as a therapeutic strategy to prevent neurodegeneration and glial activations in ALSGlial reactivitymiR-124 modulationMotor neuron degenerationSpinal cordSecretomeTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a progressive and fatal neurodegenerative disease characterized by the loss of motor neurons (MNs) from the motor cortex, brainstem and spinal cord (SC). Despite being studied for several years, there are only two available therapies, each one playing a modest impact on disease outcome. Initially, it was thought initially that the disease was only caused by motor neuron degeneration, but today it is known that ALS is a non-cell-autonomous disease involving glial cells, which show several dysfunctionalities considered to be aberrant. Glial cells were shown to lose their neuro-supportive function and to contribute to neurodegeneration and disease progression. However, it is not known which dysregulated mechanisms are affecting cell-to-cell communication, and the molecular mediators of neuronal injury, either existing as soluble factors or mediated by extracellular microvesicles. MicroRNAs (miRNAs) are non-coding RNAs whose function is to suppress gene expression through their binding to mRNAs. Lately, miRNAs were discovered as diagnostic biomarkers and potential therapeutic targets in ALS. Differentially expressed miRNAs were identified, some with recognized association with known or suggested pathways in ALS pathogenesis. miRNAs can act in a tissue-/cell-type-specific manner and are involved in cellular communication, where they may affect gene expression, either on the cells of origin or in recipient ones. MiRNA(miR)-124 is one of the most expressed in the central nervous system (CNS) and described as usually associated with neuronal differentiation. It has been found elevated in the cerebrospinal fluid of ALS patients, as well as in the ALS mice with the G93A mutation in the SOD1 gene (mSOD1), namely at active neurodegeneration sites, and identified in our studies as being upregulated in MN NSC-34 cell line with the same mutation. Interestingly, we noticed that miR-124 was upregulated in exosomes derived from such MNs, which showed to induce several activated subtypes once collected by microglia. In physiological conditions, miR-124 is involved in neuronal maturation, as well as in cell cytoskeleton organization, neurite outgrowth and autophagic regulation. Lately, dysregulation of miR-124 has been found in several CNS disorders associated with neurodegeneration, stress, neuro-immune dysregulation, and brain tumors, among others. Here, we aimed to explore the consequences of miR-124 inhibition and overexpression on the MN function and structure, as well as on microglia and astrocyte immunoregulation. For that, we used the NSC-34-MN-like cell line, either non-mutated (wild type, WT), or expressing the G93A mutation (mSOD1), which is a model that mimics the SOD1 accumulation and the neuronal degeneration observed in ALS. We transfected WT MNs with miR-124 mimic (pre-miR-124), and mSOD1 MNs with the miR-124 antagonist (anti-miR-124), to assess whether the effects produced by their secretome differently affected glia reactivity. In this sense, the collected secretome was incubated with mice microglial N9 cells for 4 h and with SC astrocytes from WT and mSDO1 8-days-old mice for 24 h. MN viability was not changed by both miR-124 modulations and that using anti-miR-124 prevented SOD1 accumulation. This one also prevented the increase in gene and protein expression of High Mobility Group Box 1 (HMGB1), as well as of the inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) protein, and of S100 Calcium-binding Protein B (S100B) mRNA. Overexpression of miR-124 in WT MNs was reflected only in S100B mRNA increase. At miRNAs level, anti-miR-124 in mSOD1 MNs decreased the overexpression of miR-125b and increased that of miR-21 and miR-146a, which were diminished in the disease model. Interestingly, pre-miR-124 in WT MNs led to the profile observed in mutated cells, namely to upregulation of miR-125b and to downregulation of miR-21 and miR-146a, validating miR-124 as a driver of such miRNA dysregulation. Importantly, anti-miR-124 was also capable of diminishing the expression of the pre-synaptic marker synaptophysin and of the retrograde transport marker dynein, both elevated in mSOD1 MNs and in WT-treated pre-miR-124 MNs, toward WT levels, highlighting miR-124 as a major contributor to such increases. In opposite, this miRNA revealed to be associated with the decrease of the post-synaptic marker PSD-95 and the anterograde transport marker kinesin, since anti-miR-124 led to a remarkable increase in the expression of their genes. Thus, we can conclude that anti-miR-124 favors anterograde transport (from soma to the end of the axon), deficient in the mutated cells, in which dynein elevation favors retrograde transport (back to the soma) described to be associated with miR-124 upregulation. Overexpressed miR-124 was also shown to relate with fewer ramifications and number of primary neurites, as well as with their increased length, which were counteracted to values close to control levels with anti-miR-124 in mSOD1 MNs. This indicates the influence of this miRNA in cytoskeleton regulation, cellular morphology, and MN function. In fact, anti-miR-124 was able to recover mitochondrial viability in mSOD1 MNs, whose decrease seems to be related with miR-124 upregulation. It also favored Mitofusin expression (an inducer of mitochondrial fusion), found diminished in mutated cells, and decreased DRP1 (associated with mitochondrial fission), increased in mutated cells. Once again, the overexpression of miR-124 showed to be involved in DRP1 upregulation in the mutated cells. Such alterations suggest the existence of oxidative stress associated with miR-124 overexpression and that anti-miR-124 may have a beneficial action by favoring anti-oxidant mechanisms. Relatively to the immunoregulatory action exerted by the MN secretome, we verified that the increased area, perimeter and Ferret’s diameter, as well the circularity reduction in microglia treated with secretome derived from mutated MNs, was not manifested upon incubation with the secretome from mSOD1 MNs treated with anti-miR-124. These parameters showed a direct correlation with the miR-124 overexpression. Microglia phagocytic ability was also affected by the secretome from WT MNs treated with pre-miR-124, as well as with that from mSOD1 modulated or not with anti-miR-124, indicating that miR-124 inhibition is not enough to recover such microglial property. However, anti-miR-124 modulation effectiveness was again manifested when the secretome from mSOD1 MNs acquired the capability to decrease the gene expression of iNOS, arginase1, Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) and Interleukin 1 beta (IL-1β). All these inflammatory genes were found upregulated in microglia treated with both mSOD1 and pre-miR-124 WT MNs. Additionally, it led to a decrease of HMGB1, highly enhanced after incubation with the secretome from mSOD1 MNs, and to an elevation of the mannose receptor CD206 expression, associated with macrophage endocytic and phagocytic properties. Interestingly, here we found an indirect correlation in that overexpressed miR-124 triggered a CD-206 gene expression decrease. In what concerns the consequences of mSOD1 MN secretome after miR-124 modulation on astrocytes, it was interesting to observe that GLT-1 levels were sustained in this condition, contrasting with the reduction found with the secretome from WT MNs treated with pre-miR-124, as well as with that from mSOD1 MNs. Similar effect was noticed on GFAP levels, whose expression increased relatively to WT and mSOD1 astrocytes treated with the secretome from mSOD1 MNs as well as the WT astrocytes exposed to the secretome from WT MNs modulated with pre-miR-124. Therefore, we can hypothesize that, at least in part, miR-124 elevation in mSOD1 MNs is associated with the production of a secretome determining GFAP and GLT-1 reduced expression, features that relate with the aberrancy of astrocytes in ALS. Overall, our results indicate that miR-124 overexpression in mSOD1 MNs has a key role in the degeneration and dysfunction of these cells, remarkably contributing to ALS pathogenesis and progression by compromising cellular homeostasis, due to a secretome with immunostimulatory and inductive aberrant features in either WT or mSOD1 astrocytes. Anti-miR-124 showed beneficial effects in preventing SOD1 accumulation in mutated MNs, while exerting synaptic transmission regulation (increase of the neuritic tree, kinesin and PSD-95), anti-oxidant effect (increased mitochondrial viability and Mitofusin and diminished DRP1) and anti-inflammatory action (increase of miR-21 and miR-146a, with decrease of miR-125b). Furthermore, secretome from mSOD1 MNs modulated with anti-miR-124 acquire properties that support microglia functionality (normal morphological characteristics and levels of iNOS, Arginase1, TNF-α, IL-1β and HMGB1 similar to those observed for the secretome from non-modulated WT MNs) and that of astrocytes (increase of GLT-1 and GFAP expression), beyond the elevation of microglial receptor CD206, associated with endocytic and phagocytic abilities. Thus, we can conclude that the decrease of miR-124 expression toward basal levels in mSOD1 MNs backup their capacity to sustain their appropriate function, while preventing a reactive glial response triggered to a secretome with immunostimulatory properties, thus counteracting neurodegeneration and disease progression. In conclusion, this work supports that the selective targeting of miR-124 in mSOD1 MNs may turn in a promising and broad therapeutic strategy for ALS treatment, by allowing the recovery of MN function and by preventing secretome-mediated glial reactivity, thus acting in multiple targets as usually intended with a combined therapy.A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal que evolui de forma progressiva e que é caracterizada pela perda de neurónios motores (NMs) do córtex motor, tronco encefálico e medula espinhal (ME). Apesar de ser estudada há vários anos a ELA é uma doença ainda sem cura. Apenas existem duas terapias disponíveis para o seu tratamento, mas com pouco impacto na progressão da doença e na saúde dos doentes. Inicialmente pensava-se ser uma doença unicamente do NM, mas atualmente sabe-se que a ELA envolve também alterações nas células gliais. Estas apresentam diversas disfuncionalidades consideradas aberrantes, perdendo a sua função de suporte aos neurónios e muito contribuindo para a neurodegeneração e progressão da doença. Desconhece-se, contudo, quais os mecanismos de comunicação célula-célula que se encontram alterados e os mediadores envolvidos, quer solúveis, quer os contidos em vesículas extracelulares, como os microRNAs (miRNAs). Os miRNAs não codificantes têm como função suprimir a expressão de genes através da sua ligação a mRNAs. Nos últimos anos, os miRNAs têm sido indicados como possíveis biomarcadores para o diagnóstico da doença e como alvos terapêuticos na ELA. Determinados miRNAs foram já encontrados como estando diferencialmente expressos, entre os quais alguns com reconhecida associação com vias conhecidas ou sugeridas como estando envolvidas na patogénese da ELA. A sua ação pode ser dirigida a um tecido, ou a um tipo de célula, sendo também elementos ativos na comunicação celular, sendo que afetam a expressão génica tanto das células de onde derivam, como das células onde vão atuar. O miRNA (miR)-124, um dos mais abundantes no sistema nervoso central (SNC) e normalmente associado à diferenciação neuronal, foi recentemente identificado como estando elevado no líquido cefalorraquidiano de doentes com ELA, bem como sobre-expresso em ratinhos com a mutação G93A no gene da SOD1 (mSOD1) nos locais de visível neurodegeneração, tendo sido por nós observado na linha celular de NMs NSC-34 com a mesma mutação, uma das mais abundantes nos casos familiares de ELA. Curiosamente, verificámos que a sua expressão estava aumentada em exossomas libertados desses NMs, os quais evidenciaram produzir ativação de diversos subtipos de microglia. Em condições fisiológicas o miR-124 encontra-se envolvido na maturação neuronal, bem como na organização do citoesqueleto celular, comprimento das neurites e processos associados à autofagia da célula. Uma desregulação na expressão de miR-124 tem sido encontrada em diversas doenças do SNC e associada a neurodegeneração, stress, desregulação neuro-imune e tumores cerebrais, entre outras. Neste trabalho o nosso objetivo foi avaliar de que modo é que a inibição ou a sobre-expressão de miR-124 se refletia na estrutura e função dos NMs, bem como na imunorregulação da microglia e dos astrócitos. Para isso, usámos uma linha de NMs expressando SOD1 humana, quer não mutada (wild type, WT), quer com mutação G93A (mSOD1), de modo a mimetizar a acumulação desta proteína e a degeneração neuronal observadas na ALS. Para avaliar de que modo o secretoma de NMs WT, após tratamento com pre-miR-124, e o de NMs mSOD1 modulados com anti-miR-124, influenciava a reatividade da microglia após 4 h de incubação e a dos astrócitos após 24 h de tratamento, usámos a linha de células microgliais de ratinho N9 e os astrócitos isolados da ME de ratinhos transgénicos SOD1G93A, com 8 dias de idade. Qualquer uma das modulações não teve reflexo na viabilidade dos NMs e a acumulação de mSOD1 foi evitada com o anti-miR-124. Este mostrou também prevenir o aumento de expressão génica e proteica da High Mobility Group Box 1 (HMGB1) e da proteína inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS), levando ainda a uma diminuição da expressão génica da S100 Calcium-binding Protein B (S100B) nos neurónios mutados. A sobre-expressão do miR-124 nos NMs WT apenas se traduziu num aumento de S100B mRNA. A nível dos miRNAs, o anti-miR-124 nos NMs mSOD1 foi capaz de diminuir a sobre-expressão de miR-125b e aumentar o miR-21 e o miR-146a, que se encontravam reduzidos. Curiosamente, o pre-miR-124 nos NMs WT conduziu ao perfil evidenciado pelas células mutadas, ou seja, a um aumento de miR-125b e a uma diminuição de miR-21 e de miR-146a, comprovando a sua contribuição em tal desregulação. Importante foi ainda observar que o anti-miR-124 reduziu a expressão do marcador pré-sináptico sinaptofisina e da proteína motora dineína, ambas elevadas nos NMs mSOD1 e WT tratados com pré-miR124, para valores próximos das células WT, ficando claro que o pre-miR-124 está por detrás de tais aumentos. Pelo contrário, este mostrou estar ligado à diminuição do marcador pós-sináptico Postsynaptic Density Protein 95 (PSD-95) e da proteína motora cinesina, já que o anti-miR-124 levou a um marcado aumento da expressão génica destas proteínas. Podemos então concluir que o anti-miR-124 favorece o transporte anterógrado (do soma para a extremidade do axónio), deficiente nas células mutadas, nas quais a elevação da dineína privilegia o transporte retrógado (de volta ao soma) associado à elevação da expressão de miR-124. Esta, mostrou estar também interligada com o menor número de ramificações e de neurites primárias, bem como do seu comprimento, as quais foram corrigidas para valores próximos dos do controlo pelo anti-miR-124 nos NMs mutados, assim indicando a sua influência no citoesqueleto celular, morfologia e funcionalidade dos NMs. De facto, o anti-miR-124 foi capaz de recuperar a viabilidade mitocondrial nos NMs mSOD1, cuja diminuição poderá estar relacionada com o aumento de expressão de miR-124, bem como ainda de favorecer a expressão de Mitofusina (que induz fusão da mitocôndria), a qual se encontrava diminuída nas células mutadas, bem como diminuir a de DRP1 (associada à fissão da mitocôndria) que estava aumentada nas mesmas. Mais uma vez a sobre-expressão de miR-124 mostrou ser responsável pelo aumento de DRP1 observado nas células mutadas, se bem que não evidenciou associação com a Mitofusina. Tais modificações são sugestivas da existência de stress oxidativo associado à sobre-expressão de miR-124 e que o anti-miR-124 poderá atuar de forma benéfica por favorecer mecanismos anti-oxidantes e protetores da mitocôndria. Relativamente à ação imunoreguladora, verificámos que tanto o aumento da área, perímetro e diâmetro de Ferrett’s, como a diminuição de circularidade da microglia após tratamento com o secretoma dos NMs mutados, não se detetavam quando a célula era tratada com o secretoma proveniente dos modulados com o anti-miR-124, sendo que tais parâmetros mostraram correlação direta com a sobre-expressão deste miRNA. De realçar, que a capacidade fagocítica da microglia revelou ser afetada quando exposta ao secretoma dos NMs WT tratados com pré-miR-124, ou ao proveniente dos mSOD1 não modulados ou modulados com anti-miR-124, indicando que este não é suficiente para repor a capacidade fagocítica da microglia. Contudo, foi de novo muito evidente a eficácia da utilização do anti-miR-124 nos NMs mutados quando o seu secretoma se mostrou eficaz na diminuição da expressão génica de iNOS, arginase, Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) e Interleukin 1 beta (IL-1β), todas elas aumentadas tanto na microglia tratada com o secretoma proveniente dos NMs mSOD1, como na tratada com o de NMs WT modulados com pre-miR-124. Ainda, conseguiu diminuir tanto a expressão de HMGB1, muito aumentada pelo secretoma de NMs mSOD1, como elevar a expressão do recetor da manose, o CD206, associado à endocitose e fagocitose nos macrófagos. Curiosamente, encontrámos aqui também uma correlação, desta vez indirecta, com a sobre-expressão neuronal do miR-124, cujo secretoma decresce a expressão de CD206. Quanto ao efeito do secretoma de NMs mSOD1 tratados com anti-miR-124 nos astrócitos WT e mSOD1, verificou-se que ele foi capaz de preservar a expressão do glutamate transporter 1 (GLT-1), encontrado diminuído nos astrócitos WT e mSOD1 após incubação com o secretoma dos NMs WT tratados com pre-miR-124 e com o dos mutados não tratados. Efeito semelhante foi obtido para a Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), cuja expressão aumentou relativamente aos astrócitos WT e mSOD1 tratados com o secretoma dos NMs mSOD1, bem como aos WT expostos ao secretoma dos NMs WT tratados com pre-miR-124. Pode-se então pensar que a expressão elevada do miR-124 no NM mutado é, pelo menos em parte, responsável pela produção de um secretoma que determina a diminuição da expressão de GFAP e de GLT-1, uma característica dos astrócitos aberrantes na ALS. Em suma, os resultados obtidos sugerem que a sobre-expressão do miR-124 nos NMs mSOD1 se encontra envolvido na disfuncionalidade e degeneração destas células e contribui marcadamente para a patogénese e progressão da ALS ao comprometer a homeostasia celular em resultado de um secretoma com propriedades imunoestimuladoras e indutor de características aberrantes nos astrócitos, quer em células saudáveis como em mutadas. O anti-miR-124 revelou ter efeitos benéficos na prevenção da acumulação de mSOD1 nos NMs, exercendo ação reguladora da transmissão sinática (aumento da árvore neurítica, da cinesina e da PSD-95), anti-oxidante (maior viabilidade mitocondrial, aumento de Mitofusina e diminuição de DRP1) e anti-inflamatória (subida de miR-21 e miR-146a, com diminuição de miR-125b). Para além disso, os NMs mSOD1 modulados com anti-miR-124 revelaram produzir um secretoma que suporta a funcionalidade da microglia (manutenção de uma morfologia normal e expressão de iNOS, Arginase, TNF-α e IL-1β e HMGB1 semelhante à encontrada após incubação com o secretoma de NMs WT), bem como a dos astrócitos (aumenta a expressão de GLT-1 e de GFAP), para além de elevar a expressão do recetor microglial CD206, associado à endocitose e à fagocitose. Desta forma, podemos inferir que a diminuição da expressão de miR-124 para níveis basais nos NMs mutados sustenta a sua funcionalidade e previne a reatividade das células gliais mediada por um secretoma com propriedades imunoestimuladoras, contrariando a neurodegeneração e a progressão da doença. Em conclusão, este trabalho sugere que o targeting do miR-124 especificamente nos NMs mSOD1 poderá ser uma estratégia terapêutica muito promissora e abrangente para o tratamento da ELA, ao permitir não só a recuperação da funcionalidade neuronal, mas também a prevenção da ativação das células gliais, significando a sua atuação em diversos alvos à semelhança do pretendido com a terapia combinada por associação de fármacos.This work was funded by Research Grant of the Santa Casa Scientific Research Program on ALS (SCML-Project ELA-2015-002 to DB), by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), (UID/DTP/04138/2013 to iMed.ULisboa and PTDC/MED-NEU/31395/2017 to DB) and by Programa Operacional Regional de Lisboa and Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (LISBOA-01-0145-FEDER-031395 to DB).Brites, Dora Maria Tuna OliveiraBotelho, Ana Rita Mendonça VazRepositório da Universidade de LisboaVizinha, Daniela Catarina Ribeiro2021-11-27T01:30:29Z2018-11-2720182018-11-27T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/39295TID:202251519enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:37:46Zoai:repositorio.ul.pt:10451/39295Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:53:04.651704Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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