The role of Nanog regulating pluripotency: a single cell approach

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Fernandes, Gonçalo Filipe Ferreira
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/30959
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
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spelling The role of Nanog regulating pluripotency: a single cell approachCélulas estaminais embrionáriasNanogPluripotênciaLineage-primingsmRNA-FISHTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017As células estaminais embrionárias (CEE) são células derivadas de células do botão embrionário ou epiblasto de blastocistos, podendo ser mantidas em cultura in vitro indefinidamente. Estas células mantêm características semelhantes às células das quais são derivadas, sendo pluripotentes e tendo capacidade de autorrenovação, ou seja, têm a capacidade de diferenciarem em todas as células existentes num organismo adulto, e a cada divisão são capazes de gerar pelo menos uma célula-filha com as mesmas características que a célula original. Devido a estas características únicas, se estas células forem colocadas num blastocisto, contribuem para o normal desenvolvimento do embrião, que se torna uma quimera, com células provenientes do blastocisto e das células estaminais embrionárias. Devido a estas razões, as CEE têm-se tornado uma ótima ferramenta para estudar o desenvolvimento embrionário. A recente descoberta de que células diferenciadas podem ser induzidas a recuperar o fenótipo de pluripotência deu um novo fôlego ao estudo dos mecanismos necessários para a indução de pluripotência e de diferenciação. Como estas células têm a capacidade de se diferenciarem em todos os tipos celulares existentes num organismo adulto, também têm sido muito estudadas para futuras aplicações em medicina regenerativa. Estas características especiais das células estaminais, pluripotência e autorrenovação, são mantidas por uma rede de fatores de transcrição, centrada em três elementos: Oct4, Sox2 e Nanog. Estes fatores de transcrição atuam em conjunto, regulando a sua própria expressão e a de outros genes envolvidos na manutenção da pluripotência, e reprimindo a expressão de genes envolvidos em diferenciação. Enquanto que Oct4 e Sox2 são homogeneamente expressos nas condições normais de cultura de células pluripotentes, Nanog é expresso de forma heterogénea, sendo muito expresso em algumas células e pouco expresso noutras. Estas células que apresentam baixa expressão de Nanog também apresentam expressão de genes normalmente associados com diferenciação. O facto destes genes serem expressos maioritariamente em células com baixa expressão de Nanog levou à criação de uma hipótese em que o Nanog poderá ser um regulador destes genes, reprimindo-os quando é expresso. O ambiente de cromatina é um dos principais reguladores da expressão genética, tendo alguns estudos desvendado uma ligação entre o Nanog e enzimas modificadoras da cromatina, como Tet1 (ten-eleven translocation 1) e Ezh2. Tet1 é uma enzima responsável pela demetilação do DNA, sendo o seu substrato as citosinas metiladas (5mC) do DNA. Ezh2 é o componente enzimático do complexo PRC2 (polycomb repressive complex 2), responsável pela metilação da lisina 27 da histona H3 (H3K27). Demetilação da 5mC é normalmente associada a ativação da expressão genética, e metilação da H3K27 associada a repressão genética. No entanto, também já foi descrito que o PRC2 se liga a regiões hipometiladas do genoma, como aquelas que são criadas pela Tet1. Neste projeto, é proposto um mecanismo de ação do Nanog na regulação dos genes envolvidos em diferenciação, em que o Nanog recruta Tet1 para as regiões promotoras desses genes, permitindo a sua demetilação (5mC para 5hmC). Estes promotores hipometilados são reconhecidos pelo PRC2, que metila as histonas H3 que estão na vizinhança, no resíduo K27. Este mecanismo foi testado através da utilização de moduladores químicos, que afetam a atividade da Tet1 e do PRC2. A atividade da Tet1 é estimulada por ácido ascórbico, também conhecido por vitamina C, e a atividade do PRC2 é reprimida por GSK343, um composto inibidor da atividade da Ezh2, a subunidade catalítica do PRC2 responsável pela metilação da histona H3. Assim, a utilização do ácido ascórbico deverá levar à repressão dos genes envolvidos na diferenciação através da estimulação da atividade da Tet1, levando ao aumento de regiões hipometiladas, à ligação do PRC2 e consequente metilação de H3K27. Por outro lado, a repressão do PRC2 deverá causar o aumento de expressão dos genes envolvidos em diferenciação devido à não metilação de H3K27. A heterogeneidade da expressão do Nanog e, por comparação, a homogeneidade do Sox2 foram analisadas através de uma técnica que permite a quantificação do número exato de moléculas de mRNA existentes numa célula, sendo que a análise de muitas células permite medir as características da população. Os nossos resultados mostram que o Nanog apresenta uma grande heterogeneidade ao nível da expressão do mRNA, com células com um reduzido número de transcritos e células com elevado número de mRNAs. Por outro lado, observa-se uma grande frequência de células com um número médio de transcritos de Sox2, e poucas células com maior ou menor número de transcritos. Entre estes dois genes existe uma correlação positiva, indicando que a maioria das células com alta expressão de um dos genes também tem alta expressão do outro, à exceção de 30% de células que apresentam alta expressão de Sox2 e baixa expressão de Nanog. Estas células correspondem às que poderão estar a explorar a pluripotência através da expressão de genes envolvidos em diferenciação. A expressão de alguns destes genes foi também analisada, com os resultados a mostrarem que a maioria das células os expressa a baixos níveis, existindo alta expressão em apenas um pequeno número de células, maioritariamente células com baixa expressão de Nanog. A expressão de Fgf5 e Sox3, dois dos genes envolvidos em diferenciação e expressos em células com baixa expressão de Nanog, foi também analisada em células de subpopulações puras com alta e baixa expressão de Nanog, sorteadas com base na presença duma proteína fluorescente, cujos níveis de expressão mimetizam a presença de Nanog. Nestas populações é possível observar uma clara distinção entre os dois estados de expressão do Nanog, em que uma população expressa altos níveis de Nanog e baixos níveis de Fgf5 e Sox3, enquanto que a outra população expressa baixos níveis de Nanog e altos níveis de Fgf5 e Sox3. Os baixos níveis de expressão destes dois genes nas células com alta expressão de Nanog permitiram a definição de alta expressão de genes envolvidos em diferenciação, definindo um limiar entre baixa e alta expressão. Tendo confirmado a heterogeneidade da expressão do Nanog e a maior expressão de genes envolvidos em diferenciação em células que apresentam baixa expressão de Nanog, o modelo proposto foi testado. O modelo foi testado numa população normal (heterogénea) e em subpopulações puras com alta e baixa expressão de Nanog (sorteadas com base na expressão de uma proteína fluorescente, que mimetiza a expressão do Nanog). Na população normal foram testados os genes Car2, Crabp2, Fgf5 e Sox3, enquanto que nas experiências com as subpopulações apenas foram testados os genes Car2 e Sox3. Os resultados obtidos com o trabalho descrito nesta dissertação corroboram, através de evidências experimentais, o modelo aqui proposto para regulação de expressão de genes envolvidos em diferenciação, dando como exemplo o Sox3, por parte do Nanog, em cooperação com Tet1 e PRC2.Embryonic stem cells (ESC) are derived from the epiblast region of blastocysts and characterized by self-renewal and pluripotency. These characteristics are maintained by the activity of the pluripotency network, at the core of which functions a trio of transcription factors, namely Oct4, Sox2 and Nanog. In cultured mouse ESCs (mESCs), Oct4 and Sox2 are homogeneously expressed, while Nanog shows a remarkable heterogeneity. Hence, it is possible to distinguish between states of low and high Nanog expression (Low- and High-Nanog, respectively), which previous work has shown to be functionally and molecularly different. In the High-Nanog state, the pluripotency network is fully active, maintaining pluripotency and repressing differentiation, whereas mESCs at the Low-Nanog state are characterized by low level expression of genes usually involved in lineage-choice and differentiation (“priming genes”). This observation led to the proposal that Nanog might be a regulator of these priming genes, and that the observed Nanog fluctuations provide windows of opportunity within the pluripotent state, during which mESCs can be primed for lineage differentiation. The chromatin environment is also a key regulator of pluripotency and differentiation, and Nanog has been shown to interact with chromatin modulating enzymes, like ten-eleven translocation 1 (Tet1) and members of the polycomb repressive complex (PRC2). Tet1 is an enzyme responsible for the demethylation of methylated cytosines (5mC) in DNA, and PRC2 is a complex responsible for the trimethylation of histone H3 at the lysine residue 27 (H3K27), on hypomethylated regions of DNA. Previous work in the Henrique’s laboratory led to a model to understand priming gene regulation by Nanog in mESCs. In this model, Nanog binds to regulatory regions of the priming genes and recruits Tet1, which will catalyse the conversion of 5mC into 5hmC to generate hypomethylated regions (normally in CpG islands). These regions are then recognized by PRC2, that would methylate associated H3 at K27, leading to repression of priming genes. As this regulation depends on Nanog expression, it should work when ESCs transit from the Low-Nanog primed state to High-Nanog, during the observed Nanog fluctuations. To test the proposed model, mESCs were exposed to small molecule chemical modulators, ascorbic acid (AA) and GSK343, which interfere with Tet1 and PRC2 activities, and gene expression was measured at the single cell level by single molecule RNA-FISH. AA is known to stimulate Tet1 activity, and GSK343 is an inhibitor of Ezh2 activity, the catalytical subunit of PRC2. According to the model, AA should decrease priming gene expression by promoting CpG demethylation of priming genes, and subsequent PRC2 recruitment and H3K27 methylation. On the contrary, GSK343-mediated Ezh2 inhibition should lead to increased priming gene expression by preventing establishment of H3K27 methylation around priming genes. The results obtained in this thesis, using Sox3 expression as an illustrative priming gene, provide experimental evidence that supports the proposed model of priming gene regulation by Nanog, working with Tet1 and PRC2.Henrique, Domingos,1960-Rodrigues, Maria Gabriela,1965-Repositório da Universidade de LisboaFernandes, Gonçalo Filipe Ferreira2019-10-29T01:30:17Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/30959TID:201856247enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:24:09Zoai:repositorio.ul.pt:10451/30959Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:46:33.826377Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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