Assessing gut precursors asymmetric cell behaviours in the zebrafish embryo

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bota, Catarina Marta Gonçalves
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/32674
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
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spelling Assessing gut precursors asymmetric cell behaviours in the zebrafish embryoAssimetria esquerda-direitaPeixe-zebraSox17Sinalização NodalMigração celularTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Externamente, o corpo dos vertebrados é simétrico bilateralmente, no entanto, órgãos como o coração, intestino, pâncreas e fígado, pulmões e a vasculatura apresentam uma assimetria relativamente ao eixo Esquerda-Direita (ED), no que diz respeito ao seu posicionamento e/ou morfologia, numa disposição conservada denominada de situs solitus. O estabelecimento do eixo ED ocorre durante a embriogénese num processo coordenado após o estabelecimento dos eixos Antero-Posterior (AP) e Dorso-Ventral (DV). Quando ocorrem anomalias durante o estabelecimento do eixo ED, vários quadros clínicos afetando a posição e morfologia destes órgãos podem surgir. Tais casos incluem situs inversus, que corresponde a uma completa inversão na disposição dos mesmos, ou heterotaxia, um espectro descrito por vários possíveis desarranjos no posicionamento, em que alguns órgãos podem apresentar normal assimetria ED e outros não. Nos vertebrados, a assimetria é estabelecida com a expressão assimétrica de Nodal, uma proteína da família TGFb, do lado esquerdo da placa mesodérmica lateral (PML). O conhecimento atual demonstra que esta quebra na simetria, na maioria dos vertebrados, ocorre numa estrutura chamada de organizador ED, dotada de cílios móveis que promovem um fluxo assimétrico do fluido que enche esta cavidade, impulsando a quebra da simetria. No peixe-zebra, este organizador é a vesícula de Kupffer (KV), formada a partir de um grupo de células localizadas numa zona adjacente ao escudo embrionário, as dorsal forerunner cells. Durante o processo de formação, esta estrutura sofre vários rearranjos, apresentando no final uma distribuição dos cílios assimétrica, com uma maior densidade na região antero-dorsal. Esta arquitetura produz um fluxo no sentido anti-horário que promove o aumento de Ca2+ intracelular nas células mais à esquerda na KV, via mecanismos envolvendo o complexo Pkd1l1-Pkd2 e a CaMK-II. Em peixe zebra há três ligandos Nodal, Cyclops, Squint e Southpaw. Southpaw (Spaw) é o ligando Nodal envolvido na quebra e transmissão de assimetria ED no peixe-zebra. A expressão de southpaw (spaw) apresenta uma forma bilateralmente simétrica em torno da KV aos 4-6 sómitos (ss). Por volta dos 10-12 ss, a expressão de spaw torna-se assimétrica na PML do lado esquerdo. Pensa-se que Dand5, uma proteína da família DAN, possa estar ativamente envolvida na formação da assimetria de spaw na PML. Aos 8 ss, dand5 apresenta uma expressão assimétrica, dependente do fluxo, mais forte do lado direito, sendo o primeiro gene assimétrico na KV. Como antagonista de Spaw, Dand5 liga-se a Spaw alegadamente mais no lado direito da KV, postulando-se que promove assim que Spaw difunda da região perto da KV em direção ao lado esquerdo da PML para lá estimular a expressão de spaw mRNA. Através de um feedback positivo, a sua expressão é amplificada na PML até aos 22 ss. Spaw também estimula a expressão de pitx2 no lado esquerdo da PML por volta dos 13 ss, e embora a sua expressão seja dependente da sinalização Nodal, em peixe zebra foi demonstrado que Pitx2 não é necessário para normal lateralização do coração e órgãos digestivos como no ratinho e outros vertebrados. Foi então sugerido que um outro gene, elovl6, expresso também no lado esquerdo da PML poderá estar envolvido no estabelecimento da assimetria dos referidos órgãos em peixe zebra. Adicionalmente, Spaw também vai levar à ativação dos seus próprios reguladores negativos, os genes lefty1 e lefty2, ficando estes restringidos à linha mediana e lado esquerdo do campo do coração, respetivamente. Adicionalmente à mesoderme, o ligando Nodal também afeta o processo de especificação e desenvolvimento da endoderme. Este envolve uma complexa e sucessiva interação de vias de sinalização e fatores de transcrição. A endoderme sofre complexos processos morfogenéticos, primeiro após a gastrulação, converge em torno da linha mediana cobrindo todo o eixo AP. O primórdio do tubo digestivo é formado pelo rearranjo das células precursoras, que polarizam e formam um lúmen por volta das 20 horas pós-fertilização (hpf) que se estende até às 42 hpf. Este tubo dará origem aos órgãos como o fígado, pâncreas e bexiga natatória. Um processo, chamado de looping do tubo digestivo, ocorre entre 26-30 hpf, no qual porções do mesmo são deslocadas da linha mediana para a esquerda da mesma. A PML foi envolvida neste processo devido às suas assimetrias migratórias que impõem o deslocamento da endoderme. O primeiro primórdio pancreático emerge também por volta das 24 hpf, o primórdio dorsal, que dará apenas origem ao tecido endócrino. O segundo primórdio, aparece bastante mais tarde, por volta das 40 hpf, o primórdio ventral que dá origem tanto a tecido endócrino como exócrino, assim como os ductos pancreáticos. O primórdio do fígado emerge entre as 24 e 28 hpf, estendendo-se da linha axial para a esquerda sobre o saco vitelínico. Tendo em conta que Nodal afeta a taxa de migração das células, nomeadamente as da endoderme e que a expressão assimétrica de dand5 muito provavelmente é responsável pela expressão assimétrica de spaw nas células da PML, neste projeto de tese, propusemos que as células migratórias da endoderme e precursoras do tubo digestivo possam ser afetadas pela sinalização Nodal (Spaw). Consequentemente, estas células podem migrar mais rápido no lado esquerdo que no lado direito, onde Spaw é supostamente inibido por Dand5. Sabendo que estas células apresentam um comportamento migratório antes da difusão da expressão assimétrica de spaw e elovl6, propomos um papel ativo para estas células. Sugerimos testar se os sinais ED, imediatamente após a quebra da simetria na KV podem afetar a padronização ED das células migratórias da endoderme. Também propomos a hipótese destas células integrarem o tubo digestivo, em formação durante estes estadios, e poderem contribuir para a formação dos órgãos assimétricos como o fígado e pâncreas. Assim, o nosso objetivo secundário, foi estudar o destino destas células da endoderme com comportamento migratório. Utilizando uma linha repórter Tg(sox17:GFP), procedemos ao estudo do comportamento migratório das células endodérmicas com captação de imagens ao vivo e análise paralela de embriões fixados. Sox17 é um marcador da endoderme permitindo visualizar as células que queremos estudar assim como a KV, o tubo digestivo e órgãos derivados do mesmo. Reportamos então neste estudo a formação de um agregado de células sox17:GFP+, não reportado anteriormente, o qual chamámos de ‘cluster’, localizado numa região posterior à KV aos 10 ss. Observámos que é a partir deste agregado que as células sox17:GFP+ começam a migrar em direção ao lado anterior do embrião aquando da passagem da KV sobre o mesmo devido ao crescimento da cauda. Este resultado levanta a questão de porque é que estas células formam este agregado posterior e não se intercalam formando o tubo digestivo como as outras sox17:GFP+. Os estudos de captação de imagens ao vivo não produziram resultados com diferenças significativas entre a ED. A falta de significância estatística foi justificada pelo tamanho sub-ótimo da amostra. Por outro lado, os estudos com embriões fixados, foram robustos em número de embriões e permitiram uma resolução excelente em profundidade. Observámos assim diferenças significativas entre ED, nomeadamente no número de células migratórias, maior no lado esquerdo aos 13 e 14 ss, assim como denotamos uma maior dispersão e distância à KV aos 14 ss. Para averiguar o destino destas células de posicionamento assimétrico, realizámos um estudo com Kaede, uma proteína fotoconvertível por UV, pelo que fotoconvertemos as células do agregado a 8ss bem como os dois grupos de células migratórias de cada lado da KV a 14 ss. No entanto, após varias tentativas os resultados obtidos não nos permitiram concluir se as células alvo incorporam o tubo digestivo. Pensamos que a proliferação celular dilui a Kaede fotoconvertida, não permitindo esta observação. Em conclusão, conseguimos caracterizar o padrão de migração das células sox17:GFP+, tendo sido observadas algumas assimetrias ED em análises temporais. Desta forma, este trabalho valida a nossa hipótese inicial em que a migração das células endodérmicas seria afetada assimetricamente em relação ao eixo ED. Propomos então um mecanismo alternativo no qual sinais ED assimétricos, ocorrentes nas células da KV podem estar a afetar o comportamento migratório da endoderme. Para tal, o próximo passo é a manipulação destes sinais assimétricos para testar se o comportamento das células sox17:GFP+ observado é alterado. Também sugerimos a continuação de estudos complementares de captação de imagens ao vivo com vista a determinar o destino das células alvo.The establishment of the left-right (LR) axis is fundamental for the correct position of visceral organs. In vertebrates, asymmetry is established with the expression of nodal, southpaw (spaw) in zebrafish, only in the left Lateral Plate Mesoderm (LPM). Current knowledge shows that in most vertebrates the symmetry breaking event occurs in a specialized structure called the LR organizer (LRO), where biophysical interactions determine the first asymmetric clues. In zebrafish, the LRO is called Kupffer’s vesicle (KV), a transient fluid-filled, monociliated organ, which appears during the early segmentation period at the posterior end of the notochord. In zebrafish, spaw expression is bilaterally symmetric in the cells surrounding the KV at 4-6 ss becoming asymmetrical in the left LPM around 10–12 ss. Motile cilia inside the KV ensure a counter-clockwise fluid flow that is important to establish the first asymmetric gene expression of dand5 at 8 ss. Dand5 is a secreted protein shown to be a potent Nodal inhibitor. The exclusive left sided southpaw (spaw) expression at the lateral plate mesoderm is thought to be the result of the earlier Dand5-Spaw inhibition near the KV. Previous data have shown a possible migration of endodermal gut precursor cells very close to the KV and other studies have demonstrated that Nodal affects cell migratory speed, namely in endodermal cells. So, we hypothesized that endodermal cells on the left side of the KV being exposed to more Spaw will migrate faster than the ones on the right side where Spaw is inhibited by Dand5. To characterize the migratory behaviour of these gut precursor cells we used the Tg(sox17:GFP) reporter line using two photon live-imaging as well as complementary time-course fixed samples. We observed that endodermal cells form a cluster at the posterior midline that is disassembled by cell migration triggered by the KV passing over it. Additionally, even though live studies did not show significant differences in measurements such as migration speed and track displacement, perhaps due to our small sample size, differences in the pattern of cell migration on the Left versus Right sides were observed in fixed embryos. These included differences in several parameters, such as the number of cells, distance to KV centroid, distance between cells. To understand if the migratory sox17:GFP+ cells were indeed incorporating the gut tube and where, we performed photoconversion experiments using Kaede. However, the results did not allow us to take such conclusions, mainly due to the fact that cell proliferation dilutes photoconverted Kaede. Still, in this study we showed that there is asymmetric positioning of migratory endodermal cells in a LR manner. We thus propose an alternative mechanism in which LR asymmetric cues that take place in the KV cells can affect endodermal migratory behaviours. Therefore, the next step will be to manipulate LR signals within the KV in order to test if the observed asymmetries are indeed originated from R>L dand5 asymmetric expression. We also suggest performing more live imaging studies in order to determine the fate of the migratory endodermal cells.Lopes, SusanaRodrigues, Maria Gabriela,1965-Repositório da Universidade de LisboaBota, Catarina Marta Gonçalves2019-12-31T01:30:15Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/32674TID:201911272enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:27:06Zoai:repositorio.ul.pt:10451/32674Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:55.089396Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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