DIA1R in zebrafish development

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Marques, José Pedro Serrado Monteiro
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/33852
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
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spelling DIA1R in zebrafish developmentHematopoieseHemangioblastosDesenvolvimentoPeixe-zebraDIA 1RTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Durante o desenvolvimento embrionário dos vertebrados, os tecidos que constituem o sistema circulatório são cruciais para a sobrevivência do embrião. O sistema circulatório fornece ao embrião oxigénio e nutrientes, e remove os resíduos metabólicos tóxicos produzidos pelos tecidos em crescimento através dos eritrócitos. Os macrófagos embrionários intervêm na remodelação de tecidos ao fagocitar possíveis agentes patogénicos e corpos apoptóticos que surgem como subproduto do desenvolvimento embrionário. Tanto a hematopoiese com a vasculogénese estão intimamente associadas. Esta observação levou à hipótese de que as células hematopoiéticas e endoteliais têm um precursor comum, o hemangioblasto. A existência deste precursor comum tem sido apoiada por estudos de diferenciação in vitro, bem como pela evidência de que os progenitores hematopoiéticos e endoteliais expressam vários genes em comum, como por exemplo vegfr2, lmo2 e scl. Durante o estudo da regulação transcricional do gene Cerberus na galinha, foi identificada uma região cis-regulatória que promove expressão génica nos hemangioblastos do saco vitelino. Este repórter específico de hemangioblastos (Hb-eGFP) permitiu isolar estas células via FACS e caracterizar o perfil de expressão génica das mesmas através de microarrays. Como esperado, os transcritos dos genes característicos de hemangioblastos foram enriquecidos na população positiva para Hb-eGFP. Além dos marcadores de hemangioblastos, esta análise levou à identificação de alguns genes não caracterizados previamente que podem estar envolvidos na diferenciação e função de hemangioblastos. Curiosamente, o segundo gene mais altamente expresso é o ortólogo do DIA1R humano (Deleted in Autism 1 Related). Os genes DIA1R são exclusivos dos vertebrados. Análise da sequência das proteínas DIA1R prevê que estas possuam um péptido sinal e um domínio cinático PIP49_C bastante conservado, característico da família FAM69 de proteínas semelhantes a cinases. Estas características sugerem que as proteínas DIA1R possam regular o tráfego molecular ou interferir na função de fatores segregados. Em relação à expressão do dia1r, o nosso grupo realizou estudos de expressão preliminares nos embriões de galinha e ratinho. Na galinha, o cDIA1R (DIA1R da galinha) é expresso em hemangioblastos de saco vitelino, ilhotas sanguíneas e nas células endoteliais da aorta dorsal, endocárdio e vasculatura da cabeça, que são regiões com potencial hemogénico. Em particular, a expressão de cDIA1R parece mais elevada em células que são morfologicamente semelhantes às células do endotélio hemogénico. No cérebro do embrião de ratinho, os transcritos mDIA1R também são detetados no endotélio vascular e na microglia. Estes dados sugerem que o DIA1R pode ser um bom marcador e potencial regulador das linhagens hematopoiéticas intraembrionárias que derivam dos hemangioblastos do saco vitelino. O peixe-zebra é também um excelente modelo para estudar o desenvolvimento do sangue. Assim, decidimos investigar onde o zDIA1R (daqui em diante dia1r) é expresso durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Descobrimos que dia1r é detetado pela primeira vez a 12 horas-pós-fertilização (hpf) na mesoderme lateral anterior (ALM) e na mesoderme lateral posterior (PLM), tecidos estes onde os primeiros precursores de células hematopoiéticas estão localizados. Nestes estádios iniciais, o padrão de expressão de dia1r é semelhante ao de scl, um dos primeiros genes a serem expressos nas células progenitoras hematopoiéticas. Às 19,5hpf, dia1r e scl são ambos expressos no ICM, o tecido hematopoiético que deriva da PLM. Às 30hpf, o dia1r é expresso na aorta dorsal e no tecido hematopoiético caudal. Nestes tecidos também é expresso lmo2, um marcador de células hematopoiéticas estaminais/progenitoras que estão presentes nestes tecidos. Em fases de desenvolvimento posteriores (48hpf a 4dpf), a expressão dia1r não foi detetada. Após a análise do padrão de expressão de dia1r, investigámos a sua função durante o desenvolvimento. Para tal, utilizámos um morfolino para impedir a tradução do gene, e iniciámos a criação de uma linha mutante utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9. Para avaliar se DIA1R tem um papel no desenvolvimento de células progenitoras hematopoiéticas, fizemos hibridação in situ (WISH) para os marcadores hematopoiéticos em embriões injetados com morfolinos (morfantes). Às 24hpf, os morfantes exibem uma maior expressão de gata1, um marcador para progenitores eritro-mielóide (EMP), e uma perda parcial da expressão de l-plastin, um marcador de macrófagos. Essas observações sugerem que os morfantes de dia1r possuem mais EMPs e menos macrófagos. Estes resultados indicam que DIA1R pode regular a proliferação e/ou a diferenciação da população de células progenitoras eritro-mielóides, promovendo a diferenciação de macrófagos. Para a avaliação semi-quantitativa do fenótipo dos morfantes de dia1r, utilizámos PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR ou qPCR) em embriões com 19,5hpf. Com esta técnica, avaliámos a expressão de nove genes que servem de marcadores para progenitores hematopoiéticos (scl, lmo2, c-myb, runx1, gata1 e spi1) e para células hematopoiéticas diferenciadas (α-eHb, l-plastin e flk1). Destes nove genes analisados, dois deles têm níveis de expressão significativamente diferentes: a expressão de lmo2 foi aumentada enquanto a expressão de l-plastin diminuiu. Embora estes dois genes tenham sido os únicos com alterações significativas dos níveis de expressão, parece haver um enviesamento para o aumento de expressão de todos os marcadores de progenitores hematopoiéticos testados. Uma vez que as EMPs derivam de progenitores hematopoiéticos que expressam lmo2, a presença de mais EMPs a 24hpf (observada na análise WISH) pode ser uma consequência de uma maior população de progenitores hematopoiéticos a 19,5hpf. A diminuição de expressão de l-plastin a 19,5hpf pode ser devida à redução do número de macrófagos nos morfantes, o que foi também observado nas experiências de WISH. Em conclusão, os resultados de qPCR juntamente com a análise WISH dos morfantes de dia1r levaram-nos a suspeitar que o DIA1R pode restringir o tamanho da população de células progenitoras hematopoiéticas, seja pela regulação da sua proliferação ou pela indução da sua diferenciação para a linhagem mielóide. Apesar da facilidade de uso de MO para estudar a função de um gene, os fenótipos induzidos por MO podem ser diferentes dos fenótipos de organismos mutantes correspondentes devido a efeitos off-target do MO ou compensação genética nos mutantes. Portanto, desenhámos uma estratégia para gerar uma linha de alelo nulo ou knockout (KO) de dia1r utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (em colaboração com a Fundação Champalimaud). Para aumentar a probabilidade de criar um KO para dia1r, escolhemos um RNA guia (gRNA) que tem como alvo o primeiro codão do dia1r. O gRNA e a proteína Cas9 foram injetados em embriões no estadio de uma célula. Nesta fase, foram recolhidos alguns embriões injetados (crispants ou F0) para genotipagem e análise fenotípica preliminar. Embora a maioria dos embriões F0 sejam mosaicos para o KO de dia1r, estes crispants podem já ter algumas alterações fenotípicas detectáveis por WISH. Usando esta técnica, avaliámos a expressão de marcadores para progenitores hematopoiéticos (c-myb), progenitores eritro-mielóides (gata1) e macrófagos (l-plastin). Para além destes marcadores, também analisámos a expressão de dia1r. A expressão de dia1r pareceu estar reduzida nos crispantes em comparação com embriões não-injetados, tal como seria de esperar num mutante mosaico para dia1r. As nossas observações também mostraram que a expressão de c-myb se encontra aumentada na ICM de crispantes. Juntamente com a observação de que o lmo2 tem maior expressão nos morfantes, os nossos resultados sugerem que a população de progenitores hematopoiéticos é maior quando se reduzem os níveis de expressão de DIA1R. Ao contrário do observado em embriões morfantes, os padrões de expressão de gata1 e l-plastin não foram afetados em embriões crispantes. Tal pode ser devido à existência de um baixo mosaicíssimo, ausência de mutações, ou mutações in-frame nos embriões crispantes de dia1r que foram testados para a expressão de gata1 e l-plastin. De um modo geral, a nossa análise funcional indica que DIA1R pode restringir o tamanho da população de progenitores hematopoiéticos. Nós também levantamos a hipótese de que DIA1R pode controlar a proliferação de células progenitoras hematopoiéticas e/ou induzir a sua diferenciação para a linhagem mielóide.During embryonic development, vasculogenesis and hematopoiesis are intimately associated. The hemangioblast is known as the common precursor cell of both endothelial and hematopoietic cells. While studying the gene expression profile of yolk sac hemangioblasts, CXorf36 or deleted in autism 1 related (dia1r) was identified as one of the most highly expressed genes. Previous experiments in chick and mouse embryos have shown that dia1r is expressed in yolk sac hemangioblasts and hemogenic endothelium, the main progenitors of primitive and definitive hematopoietic cells, respectively. This suggested that dia1r may have a significant role in blood development. Using the zebrafish as model system, we set out to characterize the pattern of expression and function of DIA1R throughout blood development. We analyzed dia1r expression by whole-mount in situ hybridization (WISH) and compare it with the expression patterns of different hematopoietic markers. We found that dia1r expression starts to be detected at 12hpf in the anterior lateral mesoderm and posterior lateral mesoderm, the first hematopoietic tissues of the zebrafish. At 19,5hpf, dia1r is expressed in the intermediate cell mass (ICM), the hematopoietic tissue that derives from the PLM, whereas at 30hpf it is detected in the dorsal aorta and caudal hematopoietic tissue, where hematopoietic stem/progenitor cells are present. To assess DIA1R function, we knocked down its translation using morpholinos, and started to generate a dia1r mutant line using CRISPR/Cas9 technology. For the phenotypical analysis of dia1r morphants, we used quantitative PCR (qPCR) to detect alterations in the expression levels of different hematopoietic markers, and WISH to analyze the distribution and size of different blood cell populations. The latter method was also used in the analysis of dia1r crispants (i.e., F0 embryos injected with gRNA and Cas9). The qPCR analysis of dia1r morphant embryos showed an up-regulation of lmo2, a hematopoietic progenitor cell marker, and down-regulation of l-plastin, a macrophage marker. Concurrently, the WISH analysis of dia1r morphants revealed that they had more erythromyeloid progenitors (derived from the ICM) and fewer macrophages. In addition, crispant embryos had slightly more cells expressing c-myb, another hematopoietic progenitor cell marker. Taken together, our results suggest that DIA1R might restrict the size of the hematopoietic progenitor cell population, either by controlling their proliferation or by promoting their differentiation into the myeloid lineage.Tavares, Ana Teresa,1971-Rodrigues, Maria Gabriela,1965-Repositório da Universidade de LisboaMarques, José Pedro Serrado Monteiro2021-03-31T00:30:17Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/33852TID:201922924enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:28:47Zoai:repositorio.ul.pt:10451/33852Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:48:41.767330Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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