The role of ovipositor extrusion during courtship in female Drosophila melanogaster

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Brotas, Margarida Caldeira
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/37269
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
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spelling The role of ovipositor extrusion during courtship in female Drosophila melanogasterDrosophila melanogasterCorteExtrusão do ovipositorGenéticaTeses de mestrado - 2018Departamento de Biologia AnimalTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Courtship is the set of behavioural interactions between sexes, with the objective of copulation, as well as the survival and fitness of the species. Drosophila melanogaster courtship includes a complex series of behaviours and it is well characterized at the circuit level. As in most species, Drosophila melanogaster males court possible partners, but the decision whether to mate or not is up to the females. Male courtship has been the focus of most courtship Drosophila melanogaster studies. Contrastingly, we still have a very poor insight on female behaviour, as well as the neuronal circuits underlying it. It is known that the female performs accepting and rejecting behaviours during courtship. Among these responses, Ovipositor Extrusion (OE) is a behaviour exclusive of courtship, which indicates its importance on this process. OE is characterized by the pushing of the vaginal plates posteriorly, projecting from the tip of the abdomen as a tube-like structure. It can be performed in two different forms: partially, when only the distal part of the ovipositor is extruded and fully, when the ovipositor is completely extruded. Classical studies consider OE a rejection behaviour, since it was observed that OE prevents copulation. Nevertheless, OE is a rare event and both receptive (virgin) and unreceptive (mated) females perform it, which complicates its interpretation. The main goal of our project is to unravel the role of female Drosophila melanogaster OE during courtship. An activation screen of a collection of lines was previously performed in Luísa Vasconcelos’s Lab. It revealed a line with two pairs of command neurons (P7 and P13) for ovipositor extrusion, which was called OE line. To further study the role of OE, we performed neuronal manipulation experiments on this line: for activating the neurons, we used Chrimson; for silencing the neurons, we used Kir2.1. We set out to record behavioural interactions between a pair of flies in a behavioural setup that, due to its high resolution, allows to dissect meticulously male courtship behaviours, as well as female responses. We annotated and analysed OE, copulation, courtship and attempted copulation behaviours. Additionally, we worked on the development of an automatic classifier for OE using JAABA software. In neuronal activation experiments, we used a closed-loop system where proximity of the male induced optogenetic activation on the female. To highlight potential advantages or disadvantages of OE, we recorded competition experiments between a virgin female that extrudes often her ovipositor and a virgin female that extrudes her ovipositor normally for a male. We also performed inactivation experiments with Kir2.1 in virgin and mated females. We found that, of the two neurons, P13 is the only one responsible for OE. We also found that inhibition of OE leads to a marked decrease in the number of attempted copulation events, suggesting OE as enticing for this behaviour. Additionally, we show that overexpression of OE leads to a decrease in copulation, which seems to indicate that OE acts as a physical barrier for copulation. However, and despite continuous neuronal activation, the intermittency of OE allows females to mate. Lastly, we show that males prefer to court and copulate with a female that performs OE normally rather than a female that performs OE more often. We believe that our findings contribute to the understanding of the role of OE, both in behavioural and neuronal terms. We found that P13 is the neuron responsible for this behaviour. We show that OE has a different meaning, depending on the sex: for females, full OE functions as a physical barrier for impeding male copulation; regarding the male, OE is enticing for attempted copulation events, whilst it has a rejecting connotation for copulation itself. Further behavioural and genetical studies will help to unveil the role of OE.A corte é o conjunto de interacções comportamentais que ocorrem entre os dois sexos, com o objectivo de cópula, assim como a manutenção da sobrevivência e fitness das espécies. A corte de Drosophila melanogaster inclui uma série de comportamentos complexos e encontra-se bem caracterizada ao nível de circuitos neurais. Os factores de transcrição Fruitless (fru) e Doublesex (dsx) especificam redes neurais específicas do sexo, que determinam comportamentos com dimorfismo sexual. À semelhança do que ocorre na maior parte das espécies, os machos da espécie Drosophila melanogaster cortejam possíveis parceiras, mas a decisão de acasalar ou não é tomada pelas fêmeas. A corte inclui uma série de comportamentos fixos efectuados pelo macho: primeiramente, este orienta-se em relação à fêmea; segue-a; toca-a no abdómen; produz uma canção de corte através da vibração de uma asa; lambe a sua genitália e, por fim, tenta copulá-la. A corte por parte dos machos tem sido o foco da maior parte dos estudos de corte de Drosophila melanogaster, visto que é composta por uma série de acções conspícuas facilmente quantificáveis. Em contraste, pouco se sabe sobre o comportamento da fêmea, assim como os circuitos neuronais responsáveis pelo mesmo. Sabe-se que a fêmea responde às acções do macho, efectuando comportamentos que variam em termos de frequência e tipo, dependendo da sua receptividade: as fêmeas maduras são altamente receptivas, copulando com os machos; por outro lado, as fêmeas que já acasalaram passam por várias alterações a nível fisiológico e comportamental. Estas não são receptivas sexualmente e colocam um número significativamente maior de ovos. Sabe-se também que as fêmeas executam comportamentos de aceitação e rejeição durante a corte. Entre estas respostas, a Extrusão do Ovipositor (EO) é um comportamento exclusivo da corte, o que indica a sua importância neste processo. A EO é caracterizada pelo empurrar posterior das placas vaginais, que projectam da ponta do abdómen como uma estrutura em forma de tubo. Pode ser efectuada de duas formas diferentes: parcialmente, quando apenas a parte distal do ovipositor é extruída, e completamente, quando o ovipositor é extruído na sua totalidade. Estudos clássicos consideram a EO como um comportamento de rejeição: Bastock e Manning encontraram uma tendência significativa para a corte do macho parar após a ocorrência da EO; Connolly e Cook sugeriram que a EO tem como função principal previnir a cópula, visto que este comportamento é efectuado principalmente por fêmeas acasaladas. Contudo, Welbergen et al., sugerem que a OE induz comportamentos de corte do macho, tais como tentativa de cópula e canção de corte. Labsleiz et al. demonstra que a extrusão parcial estimula a corte por parte do macho, enquanto a extrusão completa a inibe. Contudo, o facto de a EO ocorrer em baixa frequência e ser efectuada tanto por fêmeas (virgens), como não receptivas (acasaladas) dificulta a sua interpretação. A disponibilidade de tecnologias, tais como ferramentas de manipulação genética de um número restrito de células, assim como a observação de estruturas de pequenas dimensões reccorrendo a gravação de vídeo de alta resolução, permitem estudar melhor a corte em Drosophila melanogaster. O objectivo principal deste projecto é desvendar o papel da EO da fêmea Drosophila melanogaster na corte. Um screen de activação de uma colecção de linhas que marcam interneurónios descendentes foi efectuado anteriormente no laboratório de Luísa Vasconcelos. Este revelou uma linha com dois pares de interneurónios-comando (P7 e P13) para a EO, a qual chamámos OE line. Para estudar a EO, utilizámos esta linha para efectuar experiências de manipulação neural. Para activação neuronal, utilizámos uma ferramenta optogenética: Chrimson, um canal controlado pela incidicência de luz. Esta ferramenta permite estimulação cerebral directa em Drosophila melanogaster. A fim de haver uma produção funcional de de Chrimson, é necessário fornecer t-Retinal como suplemento alimentar. Este facto permitiu criar o nosso grupo de controlo para experiências de activação neuronal, constituído por fêmeas sem t-Retinal como suplemento alimentar. Para inactivação neuronal, utilizámos o canal depotássio de rectificação Kir2.1. Este causa sobreexpressão dos canais de potássio que se encontram abertos no potencial de repouso da membrana, levando à supressão da actividade eléctrica dos neurónios onde é expresso. Gravámos as interacções comportamentais entre um par de moscas num setup comportamental durante 20 minutos ou até à ocorrência de cópula. Este setup, devido à sua elevada resolução, permite compreender detalhadamente os comportamentos de corte do macho, assim como as respostas da fêmea. Posteriormente, procedemos à anotação manual de comportamentos de EO, cópula e tentativa de cópula. Em relação à anotação de corte, utilizámos um classificador automático previamente desenvolvido no laboratório, recorrendo ao software JAABA. Tendo em conta este software, trabalhámos no desenvolvimento de um classificador automático para a EO, a fim de reduzir o trabalho providenciado pelas anotações manuais. Em experiências de activação neuronal, utilizámos um sistema closed-loop, onde a proximidade do macho induzia activação optogenética na fêmea. Numa tentativa de sublinhar potenciais vantagens ou desvantagens da EO, filmámos experiências de competição entre uma fêmea virgem que extruía o seu ovipositor frequentemente e uma fêmea virgem que extruía o seu ovipositor normalmente por um macho. Efectuámos também experiências de inactivação neuronal em fêmeas virgens e acasaladas. Por último, realizamos ainda experiências de activação neuronal contínua a fêmeas virgens com t-Retinal pertencentes a diferentes linhas, em que a EO ocorre. Descobrimos que, dos dois neurónios, apenas o P13 é o responsável pela EO e que este é positivo para o gene dsx e negativo para o gene fru. Verificámos que o silenciamento do neurónio P13 em fêmeas acasaladas levou a uma inibição total da EO, assim como a um decréscimo demarcado no número de tentativas de cópula, sugerindo que a EO é atractiva para este comportamento. Também verificámos que a activação neuronal da OE line levou a uma sobreexpressão da EO em fêmeas virgens, assim como a um decréscimo na cópula. Tal parece indicar a EO como uma barreira física para a ocorrência de cópula. Contudo, e apesar da activação neuronal contínua, a intermitência da EO permite que as fêmeas ainda consigam acasalar, o que parece demonstrar que a EO não é totalmente eficaz a bloquear a cópula. Demonstrámos também que os machos preferem cortejar e copular com uma fêmea que extrui normalmente o seu ovipositor do que uma fêmea que o extrui mais frequentemente, o que indica que a EO não é propriamente vantajosa para a fêmea. Descobrimos ainda que o silenciamento do neurónio P13 em fêmeas virgens não leva à inibição da EO. Tal pode ser explicado pelo facto de o neurónio P13 apenas actuar em eventos de EO completa e as fêmeas virgens apenas executarem EO parcial. Acreditamos que estas descobertas contribuem para a compreensão do papel da EO, tanto em termos comportamentais, como em termos de redes neurais envolvidas neste comportamento. Descobrimos que o neurónio P13 é o responsável pela EO. Também descobrimos que a EO tem um significado diferente, dependendo do sexo: no caso das fêmeas, a extrusão completa funciona como uma barreira física, que impede a cópula; em relação ao macho, a EO é atractiva para tentativas de cópula, enquanto tem uma conotação de rejeição para a cópula em si. Estudos futuros a nível comportamental e genético ajudarão a compreender melhor o papel da EO. Nesse sentido, seria interessante estudar qual o factor que leva ao despoletar da EO na fêmea, assim como compreender um pouco melhor a componente química deste comportamento.Vasconcelos, Maria LuísaSucena, José Élio da SilvaRepositório da Universidade de LisboaBrotas, Margarida Caldeira2019-03-01T15:24:20Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/37269TID:202185974enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:34:24Zoai:repositorio.ul.pt:10451/37269Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:51:22.477066Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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