Estudo do papel neuroprotector da insulina a agressões celulares: amilóides, oxidativas e de membrana

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Nascimento, Ana Margarida Santos do
Data de Publicação: 2009
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/3679
Resumo: Tese de mestrado, Bioqímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009
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spelling Estudo do papel neuroprotector da insulina a agressões celulares: amilóides, oxidativas e de membranaInsulinaNeuroprotecçãoCálcioAmilóidesCanais de potássioTeses de mestrado - 2009Tese de mestrado, Bioqímica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009Existem evidências recentes, mas em número crescente, que apontam para uma relação entre a doença de Alzheimer e a diabetes. A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa em que as conhecidas perdas nas faculdades cognitivas são, em grande parte, devidas a uma considerável taxa de morte neuronal. O peptídeo betaamilóide (βA) é apontado como um agente importante no contexto da neurotoxicidade associada com DA. Outros agentes considerados relevantes nesta doença são o peróxido de hidrogénio, que promove stress oxidativo em neurónios e a transtirretina (TTR), uma vez que é conhecido o seu papel como transportadora de βA e, se mutada, pode provocar morte neuronal. Já a insulina é apontada como potencial agente neuroprotector constituindo uma oportunidade terapêutica para a DA. Apesar de haver ainda pouca informação sobre a função da insulina no cérebro, sabe-se que modula a actividade neuronal e consequentemente as funções cognitivas. Nomeadamente, eventos de plasticidade sináptica como LTP (Long Term Potentiation), o paradigma experimental da memória, podem ser modulados pela insulina. Contudo o processo facilitador da insulina no LTP e na memória não é entendido, assim como muitos dos mecanismos consequentes à activação dos receptores de insulina expressos em regiões especificas do cérebro como o hipocampo. No entanto, foi revelado por este laboratório um papel inibitório da insulina em correntes neuronais de potássio que, aumentando a neuroexcitabilidade, pode facilitar a indução de LTP. Este trabalho procurou aprofundar o conhecimento sobre as faculdades neuroprotectoras da insulina, estudando o plausível papel neuroprotector desta em relação a agressores associados à DA. Em células de neuroblastoma N1E-115, averiguou-se se a neuroprotecção pela insulina se processa através da mesma via recrutada na modulação nos canais de potássio ou se recruta uma via independente. Para tal elaboraram-se ensaios de viabilidade celular (MTT) com insulina e com Way- 123,398-A-5 (WAY), bloqueador específico dos canais tipo ERG, responsáveis pela corrente de K+ sensível à insulina nas células N1E-115 (Lima et al., 2008). Assim, na presença de insulina ou WAY, adicionaram-se os agressores em estudo. Efectuaram-se também ensaios de fluorescência, marcando as células com o indicador sensível ao cálcio (Ca2+) Fluo-3AM, afim de se estudar a dinâmica do Ca2+ face à insulina e também, face à exposição com H2O2 e TTRs. Os decréscimos na viabilidade celular induzidos por H2O2, Aβ1-42, e TTR 55’ foram claramente atenuados pela insulina mas inalterados com o WAY. Tais resultados demonstram que a neuroprotecção inferida pela insulina não recruta a mesma via que é mobilizada na modulação dos canais ERG. O H2O2 e TTR55’ evocaram um aumento persistente no Ca2+ citosólico, consistente com o efeito neurotóxico, ao passo que a insulina evocou um aumento transitório, coerente com o seu efeito neuroprotector. A insulina não contrariou a mortalidade induzida pelo DMSO e os resultados com H2O2 mostraram que existe um efeito neuroprotector por parte da insulina e que esse efeito é tanto maior quanto mais intensa for a agressão. Tais resultados sugerem que a neuroprotecção da insulina é eficaz em situações de stress oxidativo mas não em casos em que a integridade da membrana é comprometida. A TTR wt aumentou a sobrevivência celular ao passo que a TTR 55’ a reduz; consistente com tais factos, a TTR wt induz um aumento breve, e pequeno no Ca2+ citoplasmático contrastando com uma elevação considerável, lenta e persistente nos níveis de Ca2+ causada pela TTR 55’. O presente trabalho mostra que a activação do receptor da insulina leva a uma neuroprotecção não recorrendo à via de modulação da neuroexcitabilidade, segundo um fenómeno associado a alterações na dinâmica de Ca2+ mas discute o envolvimento de outra via independente do Ca2+.Recent research has revealed a relationship between Alzheimer's disease (AD) and diabetes. AD is a neurodegenerative disease characterised by cognition losses, mainly due to neuronal death. The Recent research has revealed a relationship between Alzheimer's disease (AD) and diabetes. AD is a neurodegenerative disease characterised by cognition losses, mainly due to neuronal death. The β-amyloid peptide (Aβ) is a major protagonist in the neurotoxicity associated with AD. Other relevant ‘players’ in the AD context are the hydrogen peroxide, which promotes oxidative stress and transthyretin (TTR), which is able to act as an Aβ carrier and, when mutated, to promote cell death. On the other hand, insulin is described as a neuroprotective agent. Although information about brain insulin is still scarce, it is known that insulin modulates neuronal activity. In particular, events of synaptic plasticity such as LTP (long-term- potentiation), the experimental paradigm for memory and learning, can be facilitated by insulin. Such facilitation is not yet understood. In our laboratory, an inhibitory role of insulin on neuronal potassium currents was revealed (Lima et al., 2008). It was postulated that the consequent increase in neuroexcitability may facilitate the induction of LTP. The present study aims to deepen the knowledge about the insulin neuroprotection to AD related insults. In differentiated neuroblastoma cells N1E-115, addressed the question whether the neuroprotection by insulin occurs through the same cell-pathway as the one recruited for the modulation of potassium channels. To do so, cell viability tests (MTT) were used, using insulin and Way-123,398-A-5 (WAY), a specific blocker of ERG-type channels which underlies the insulin sensitive K+ current in N1E-115 cells (Lima et al., 2008). In the presence of insulin or WAY, the AD related insults were applied and the results compared. Fluorescence recordings from cells loaded with the Ca2+ sensitive indicator Fluo-3 AM were conducted to study if Ca2+ dynamics is altered by insulin as well as by H2O2 or TTRs. The disclosed decreases in cell viability induced by H2O2, Aβ1-42 and TTR 55' were attenuated by insulin treatment but unchanged by WAY. These results demonstrate that the neuroprotection induced by insulin does not recruit the same pathway as the one utilised by the modulation of ERG channels. Application of H2O2 and TTR 55' evoked a persistent increase in Ca2+, consistent with the neurotoxic effect, while insulin evoked a transient Ca2+ increase, consistent with its neuroprotective effect. Insulin did not reverse the cell-death induced by DMSO, but instead showed an neuroprotective effect against H2O2. This suggested that the neuroprotection by insulin is effective in situations of oxidative stress but not in cases where membrane integrity is compromised. TTR-wt increased cell survival while TTR 55' reduce it. These observations are concordant with the recordings showing that TTR wt evokes a small and transient increase in Ca2+ , whereas, a larger and sustained Ca2+ elevation is induced by TTR 55'. The present work shows that activation of the insulin receptor leading to neuroprotection does not recruit the same cell-pathway as the one leading to the modulation of neuroexcitability. It is a phenomenon associated with changes in Ca2+ dynamics but the involvement of another pathway independent of Ca2+ is discussed.-amyloid peptide (A_) is a major protagonist in the neurotoxicity associated with AD. Other relevant ‘players’ in the AD context are the hydrogen peroxide, which promotes oxidative stress and transthyretin (TTR), which is able to act as an A_ carrier and, when mutated, to promote cell death. On the other hand, insulin is described as a neuroprotective agent. Although information about brain insulin is still scarce, it is known that insulin modulates neuronal activity. In particular, events of synaptic plasticity such as LTP (long-term- potentiation), the experimental paradigm for memory and learning, can be facilitated by insulin. Such facilitation is not yet understood. In our laboratory, an inhibitory role of insulin on neuronal potassium currents was revealed (Lima et al., 2008). It was postulated that the consequent increase in neuroexcitability may facilitate the induction of LTP. The present study aims to deepen the knowledge about the insulin neuroprotection to AD related insults. In differentiated neuroblastoma cells N1E-115, addressed the question whether the neuroprotection by insulin occurs through the same cell-pathway as the one recruited for the modulation of potassium channels. To do so, cell viability tests (MTT) were used, using insulin and Way-123,398-A-5 (WAY), a specific blocker of ERG-type channels which underlies the insulin sensitive K+ current in N1E-115 cells (Lima et al., 2008). In the presence of insulin or WAY, the AD related insults were applied and the results compared. Fluorescence recordings from cells loaded with the Ca2+ sensitive indicator Fluo-3 AM were conducted to study if Ca2+ dynamics is altered by insulin as well as by H2O2 or TTRs. The disclosed decreases in cell viability induced by H2O2, A_1-42 and TTR 55' were attenuated by insulin treatment but unchanged by WAY. These results demonstrate that the neuroprotection induced by insulin does not recruit the same pathway as the one utilised by the modulation of ERG channels. Application of H2O2 and TTR 55' evoked a persistent increase in Ca2+, consistent with the neurotoxic effect, while insulin evoked a transient Ca2+ increase, consistent with its neuroprotective effect. Insulin did not reverse the cell-death induced by DMSO, but instead showed an neuroprotective effect against H2O2. This suggested that the neuroprotection by insulin is effective in situations of oxidative stress but not in cases where membrane integrity is compromised. TTR-wt increased cell survival while TTR 55' reduce it. These observations are concordant with the recordings showing that TTR wt evokes a small and transient increase in Ca2+ , whereas, a larger and sustained Ca2+ elevation is induced by TTR 55'. The present work shows that activation of the insulin receptor leading to neuroprotection does not recruit the same cell-pathway as the one leading to the modulation of neuroexcitability. It is a phenomenon associated with changes in Ca2+ dynamics but the involvement of another pathway independent of Ca2+ is discussed.Lima, Pedro A.Repositório da Universidade de LisboaNascimento, Ana Margarida Santos do2011-07-11T11:39:14Z20092009-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/3679porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:44:17Zoai:repositorio.ul.pt:10451/3679Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:29:31.288050Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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