The role of NRARP in the pathogenesis of T-cell acute lymphoblastic leukemia

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pinto, Inês Garcia Brandão e Silva
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/32852
Resumo: Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017
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spelling The role of NRARP in the pathogenesis of T-cell acute lymphoblastic leukemiaT-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL)NOTCH signalingWNT signalingNRARPLEF1Teses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a severe hematologic malignancy, commonly associated with high frequency of relapse. NOTCH signaling is a hallmark of T-ALL pathogenesis and more than 50% of T-ALL cases harbor NOTCH activating mutations. Despite considerable clinical advances throughout the years, NOTCH signaling inhibition cannot be efficiently achieved, due to weak therapeutic effects and severe toxicity. NRARP is a negative regulator of the NOTCH pathway and a transcriptional target of NOTCH. It is known to regulate both T-cell lineage commitment and early differentiation. Importantly it has been shown that in NOTCH-induced T-ALL, loss of the microRNA181ab1 inhibits T-ALL development, partly by de-repressing NRARP. NRARP further modulates WNT signaling, by stabilizing LEF1, a transcription factor acting downstream of WNT pathway, shown to induce the malignant transformation of murine thymocytes. Altogether, these findings suggest that a deregulation of NRARP function may play a role in T-ALL. Thus, the main goal of this project is to understand the role of NRARP in T-ALL pathogenesis and evaluate its therapeutic potential. We started by determining NRARP expression in human T-ALL cells. We observed that NRARP protein levels are significantly increased in T-ALL comparing with human thymocytes. This result, although consistent with the fact that NRARP is a transcriptional target of NOTCH, suggests that NRARP is not sufficient to block NOTCH oncogenic signals. To test this hypothesis, we overexpressed NRARP in human T-ALL cell lines. Intriguingly, even though we observed a block in NOTCH signaling in all cell lines analyzed, functional studies revealed that while some T-ALL cells proliferate less upon NRARP overexpression, some proliferate more. Importantly, this suppression or promotion of cell expansion correlated with the changes observed in cell cycle progression (delayed or accelerated, respectively) and cMYC expression (downregulated or upregulated, respectively) in NRARP overexpressing cells and, curiously, with the mutational status of NOTCH (mutated or wild-type, respectively). Altogether, our results suggest that NRARP is capable of blocking NOTCH signaling independently of NOTCH mutational status. Nonetheless, in T-ALL cells that depend on NOTCH oncogenic signals (NOTCH mutated cells), NRARP overexpression has a “tumor-suppressor”-like function, whereas in leukemia cells that do not depend on NOTCH oncogenic signals (NOTCH wild-type) it plays an oncogene-like role. Further studies are necessary to understand if WNT signaling contributes to this dual role of NRARP in T-ALL.A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) é uma neoplasia hematológica severa, resultante da expansão clonal de progenitores linfóides de células T, representando cerca de 15% dos casos de adultos e 25% dos casos pediátricos de leucemia linfoblástica aguda (LLA). Apesar do prognóstico de doentes com LLA-T ter melhorado significativamente ao longo dos anos, a taxa de recidiva é ainda elevada e o prognóstico dos doentes com doença resistente à terapia ou recidivante é muito reservado. A via de sinalização NOTCH é fundamental para a regulação de processos de homeostasia e regeneração de tecidos e desempenha funções muito importantes na hematopoiese. O compromisso de progenitores linfóides para com a linhagem T e os passos iniciais do desenvolvimento de células T no interior do timo são processos regulados pela sinalização da via NOTCH. Desta forma, não é de estranhar que a sua desregulação seja uma característica da patogénese de LLA-T, e que mutações em NOTCH, levando a uma activação constitutiva da via, se verifiquem em mais de 50% dos casos. A identificação destas mutações levou ao desenvolvimento de terapias dirigidas para esta via. A inibição da via NOTCH foi alcançada essencialmente pelo uso de inibidores da γ-secretase. Estes inibem a via NOTCH ao bloquearem a clivagem final do receptor NOTCH, impedindo desta forma que a sua forma activa seja translocada para o núcleo e, consequentemente, que actue como factor de transcrição. No entanto, verificou-se posteriormente que a sua utilização terapêutica tem efeitos anti-leucémicos reduzidos, associados a efeitos secundários graves, a nível intestinal. Outras abordagens terapêuticas, tais como a utilização de anticorpos que têm como alvo receptores e ligandos da via NOTCH, foram desenvolvidas, mas também estas apresentam efeitos secundários severos, tais como a indução de tumores vasculares e toxicidade hepática. Desta forma, uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na sinalização via NOTCH em LLA-T poderá originar terapias mais eficazes e seguras. Recentemente, foi demonstrado que a perda de expressão do microRNA miR-181ab1 inibe o desenvolvimento de LLA-T induzido pela activação de NOTCH1, em parte devido ao aumento da expressão de NRARP. Este último é um alvo transcricional da via de sinalização NOTCH e um regulador negativo da mesma. É também importante realçar que a sobre-expressão deste gene em células estaminais hematopoiéticas de ratinho compromete a especificação de células na linhagem T e a sua posterior diferenciação em timócitos. Igualmente importante é o facto de ter sido demonstrado que NRARP está associado à via de sinalização WNT através da estabilização do factor de transcrição LEF1, capaz de induzir transformação maligna de timócitos de ratinho. Desta forma, a desregulação da função de NRARP pode desempenhar um papel na patogénese de LLA-T. Assim, o principal objectivo da presente dissertação é estudar o papel de NRARP no desenvolvimento desta doença. Começámos por caracterizar a expressão de NRARP em células de LLA-T, quantificando para tal os níveis de expressão de mRNA e proteína de NRARP em linhas celulares e amostras primárias. Além disso, para investigar a sua função nestas células, NRARP foi sobre-expresso em algumas linhas celulares de LLA-T, por transdução lentiviral. Estas células foram usadas para avaliar os efeitos de NRARP na sinalização de NOTCH, através da quantificação da expressão da forma intracelular de NOTCH, bem como de alvos a jusante desta via. Foram ainda executados ensaios funcionais nas mesmas células, nomeadamente ensaios de proliferação e viabilidade, bem como de progressão do ciclo celular. Verificámos que os níveis de proteína de NRARP estão significativamente mais elevados em células de LLA-T, comparando com timócitos saudáveis. Este resultado é consistente com o facto de NRARP ser um alvo transcricional da via NOTCH, comumente hiper-activado num contexto de LLA-T. Por outro lado, sendo NRARP um regulador negativo da via NOTCH, estes resultados sugerem que os níveis de NRARP não são suficientes para bloquear os sinais oncogénicos produzidos por esta via. Para testar essa hipótese, procedemos à sobre-expressão de NRARP em linhas celulares humanas de LLA-T e analisámos os efeitos na via NOTCH. No geral, observámos que a sobre-expressão de NRARP suprime a via NOTCH, resultando não só numa diminuição dos níveis da forma intracelular e activa de NOTCH, bem como no decréscimo da maioria dos alvos transcricionais analisados. Contudo, é importante realçar que os níveis do oncogene cMYC, um importante alvo desta via, estavam diminuídos num grupo de linhas celulares, mas aumentados num outro grupo. Curiosamente, a análise funcional da sobre-expressão de NRARP revelou que, apesar da via de sinalização NOTCH estar bloqueada, em algumas linhas celulares NRARP inibe a proliferação, mas noutras promove a sua expansão. A análise da viabilidade e do ciclo celular, demonstrou que a sobre-expressão de NRARP não tem um impacto significativo a nível da viabilidade na maioria das linhas celulares analisadas, mas afecta a progressão do ciclo celular. Estes resultados são consistentes com as observações a nível proliferativo e com as diferenças observadas na expressão de cMYC. Ou seja, nas linhas celulares em que a sobre-expressão de NRARP induz uma diminuição na proliferação, observámos atrasos na progressão do ciclo celular e uma diminuição da expressão de cMYC. Nas linhas celulares em que a sobre-expressão de NRARP resulta num aumento da proliferação, verificámos uma progressão mais rápida no ciclo celular e um aumento na expressão de cMYC. Uma observação interessante é o facto de as linhas celulares cujo crescimento é diminuído por NRARP apresentarem mutações em NOTCH, enquanto as linhas cujo crescimento é favorecido por NRARP, não apresentarem mutações neste gene. Com base nestes resultados, formulámos a hipótese de que a sobre-expressão de NRARP, para além de bloquear a via de sinalização NOTCH, pode afectar directa ou indirectamente outra(s) via(s). Uma vez que NRARP regula LEF1, um factor de transcrição da via WNT, investigámos os efeitos da sobre-expressão de NRARP na via de sinalização WNT. Ainda que bastante preliminares, os nossos resultados sugerem uma diminuição na activação da via WNT nas linhas celulares com um crescimento mais lento. Curiosamente, observámos ainda nestas linhas uma ligação entre NRARP e uma isoforma de LEF1, descrita como tendo um papel negativo na via WNT. Por outro lado, nas linhas celulares com crescimento mais rápido. observámos a interacção de NRARP com outra isoforma de LEF1, possivelmente a isoforma full-lenght. Contudo, é importante ressalvar que estes resultados são preliminares e necessitam de ser validados. Em suma, os resultados obtidos sugerem que NRARP pode desempenhar funções opostas em LLA-T. Apesar de NRARP ser capaz de bloquear a via NOTCH em todas as linhas celulares analisadas, em células que não dependam de sinais oncogénicos produzidos por NOTCH (NOTCH wild-type), NRARP poderá afectar outra via de sinalização, tendo um papel oncogénico. Em células dependentes dos sinais oncogénicos de NOTCH (NOTCH mutado), NRARP terá um papel de supressor tumoral. A importância da via WNT e o envolvimento de LEF1 nesta dualidade na função de NRARP requer estudos mais extensivos.Fragoso, Ana Rita Freitas Martins de Matos, 1978-Barata, João TabordaRepositório da Universidade de LisboaPinto, Inês Garcia Brandão e Silva2020-04-01T00:30:15Z20172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/32852TID:201681900enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:27:23Zoai:repositorio.ul.pt:10451/32852Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:48:01.610915Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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