DBS - "Dried Blood Spots" : estudo sobre a sua aplicação na área da toxicologia forense

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Simões, Susana Maria dos Santos Sadler, 1973-
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/27267
Resumo: Tese de mestrado, Medicina Legal e Ciências Forenses, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016
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spelling DBS - "Dried Blood Spots" : estudo sobre a sua aplicação na área da toxicologia forenseDried Blood SpotsUPLC-MS/MSDrogras de abusoValidaçãoTeses de mestrado - 2016Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Medicina Legal e Ciências Forenses, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016O presente trabalho teve por objetivo estudar a aplicabilidade das DBS e suas vantagens no âmbito da toxicologia forense, a partir do desenvolvimento e validação de uma metodologia baseada nesta técnica de amostragem em combinação com a tecnologia UPLC-MS/MS, para a confirmação e quantificação de anfetaminas, opiáceos, cocaína, metadona e metabolitos, num total de 11 substâncias. As amostras DBS, preparadas a partir de um volume de sangue de 50 μL, foram extraídas com 3 mL de uma mistura metanol/acetonitrilo (3:1, v/v) ao qual foram adicionados os PIs. A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna Acquity UPLC® HSS T3 (100 mm x 2,1 mm; 1,8 μm) e uma fase móvel formada por acetonitrilo e formato de amónio 2 mM (ácido fórmico 0,1%). A deteção foi concretizada com um espectrómetro de massa/massa triplo quadrupolo operando no modo de ionização ESI + e de aquisição MRM, com duas transições iónicas por substância. O método demonstrou ser seletivo e o efeito de matriz foi considerado não significativo, com exceção para a morfina e EDDP para as quais se observou uma supressão relevante do sinal, situação corrigida através da utilização dos respetivos análogos deuterados como PIs. A eficiência da extração apresentou recuperações entre 42% e 91%, e não se observaram fenómenos de arrastamento. Apesar do volume pequeno de amostra, a combinação com a técnica analítica de elevada sensibilidade permitiu atingir valores de LD e de LQ baixos, entre 0,5 – 1 ng/mL e 1 – 5 ng/mL, respetivamente. A linearidade foi estudada na gama de trabalho do correspondente LQ a 500 ng/mL, tendo-se obtido 2 superiores a 0,994, e selecionado o modelo da regressão linear ponderada com um fator de 1/, para todas as substâncias. O método desenvolvido ofereceu bons resultados para a repetibilidade e precisão intermédia, com CV de 3,8 – 14% e 5,3 – 13%, respetivamente. A exatidão apresentou valores de bias entre -9,3% e 7,9%. A experiência para testar a integridade da diluição de amostras DBS cuja concentração é superior ao último calibrador, foi avaliada a uma concentração de 800 ng/mL tendo-se obtido recuperações entre 82% e 102% e CV ≤ 4,8%. Foi ainda realizado um estudo de estabilidade dos analitos nas DBS por um período de armazenamento máximo de 8 meses, a três temperaturas (temp. amb., 2 – 8ºC e -10ºC), tendo-se obtido os melhores resultados para as amostras a -10ºC, com valores de diferença percentual da concentração relativamente aos controlos positivos, inferiores ou iguais ±15%, para todas as substâncias, e os piores resultados para as amostras armazenadas à temperatura ambiente com sinais de alterações evidentes, no caso, da morfina, 6-MAM, anfetamina, MDA, benzoilecgonina e cocaína. Após a validação, o procedimento foi aplicado a 64 amostras reais (correspondendo a 92 resultados positivos). Os resultados foram comparados com os obtidos a partir de metodologias utilizadas por rotina no SQTF, baseadas em amostras de sangue total preparadas por SPE e analisadas por GC-MS. Do tratamento estatístico realizado, concluiu-se que, tendo em conta o tipo e diversidade das amostras analisadas, a correlação obtida entre os resultados foi boa. O trabalho desenvolvido e os resultados obtidos neste estudo permitiram avaliar as possibilidades, benefícios e limitações da utilização da técnica de DBS na área da toxicologia forense, e concluir que apesar de ainda existir muito trabalho por realizar, os resultados são promissores e as DBS podem representar uma alternativa ou um complemento das técnicas analíticas e de amostragem convencionais, podendo dar resposta a algumas das questões presentes nas diferentes aplicações da toxicologia forense.The aim of this work was to study the applicability of DBS and its advantages within the forensic toxicology, based on the development and validation of a methodology using this sampling technique in combination with UPLC-MS/MS technology, for confirmation and quantification of amphetamines, opiates, cocaine, methadone and metabolites in a total of 11 substances. The DBS samples were prepared from a blood volume of 50 uL, and were extracted with 3 mL of methanol/acetonitrile (3:1, v/v) to which the IS were added. The chromatographic separation was performed using an Acquity UPLC® HSS T3 column (100 mm x 2.1 mm, 1.8 μm) and a mobile phase consisting of acetonitrile and 2 mM ammonium formate (0.1% formic acid). The detection was accomplished with a triple quadrupole mass spectrometer, operating in the ESI+ ionisation and MRM acquisition mode, with two transitions per substance. The method shown to be selective and the matrix effect was considered not significant, except for morphine and EDDP, for which a significant suppression of the signal was obtained. The extraction recoveries were between 42% and 91%, and no carryover was observed. Despite the small sample volume, the combination with a high sensitivity analytical technique allowed to reach low values of LOD and LOQ, ranging from 0.5 to 1 ng/mL and 1 to 5 ng/mL, respectively. The linearity was studied in the range of the corresponding LOQ to 500 ng/mL, with 2 ≥ 0.994 and a weighted 1⁄ linear regression was selected, for all the substances. The developed method gave good results for intraday and interday precision with CV values of 3.8 to 14% and 5.3 to 13%, respectively. The accuracy presented a bias ranging from -9.3% to 7.9%. The dilution integrity of the DBS samples was evaluated at a concentration of 800 ng/mL. Good results were obtained with recoveries between 82% and 102% and CV ≤ 4.8%. It was also performed a stability study of the analytes in the DBS samples for a maximum storage period of eight months at three different temperatures (room temperature, 2 to 8°C and -10°C). The best results were obtained for the samples at -10°C, with a percentage difference with respect to the quality control samples concentration, less than or equal to ± 15%, for all the substances. The poorest results were obtained for the samples stored at room temperature, showing obvious concentration deviations in the case of morphine, 6-MAM, amphetamine, MDA, benzoylecgonine and cocaine. After validation, the procedure was applied to 64 real samples (corresponding to 92 positive results). The results were compared with those obtained from the methodologies routinely applied in the SQTF, based on whole blood samples prepared by SPE and analyzed by GC-MS. Taking into account the nature and diversity of the samples analysed, the statistical analysis allowed to established that the correlation between the results was acceptable. To conclude, the work and the results achieved during this study permitted to evaluate the possibilities, benefits and limitations of using the DBS technique in the forensic toxicology field, and to determine, that although there is still much work to be done, the results are promising and DBS can represent an alternative or a complement to conventional analytical and sampling techniques, allowing to respond to some of the present issues concerning the different forensic toxicology applications.Dias, Mário JoãoSantos, Jorge Costa, 1948-Repositório da Universidade de LisboaSimões, Susana Maria dos Santos Sadler, 1973-2017-03-24T11:06:18Z20162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/27267TID:201175584porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:18:01Zoai:repositorio.ul.pt:10451/27267Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:43:43.718170Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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