Análise de suportes de amostragem por Dried Blood Spots (DBS) aplicada ao controle de dopagem genética no esporte

• Autor(a) principal: Leite, João Victor Meirelles
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRJ
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11422/17237
• topic: CNPQ::CIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA::QUIMICA ORGANICA; Dried Blood Spots (DBS); Dopagem genética; Eritropoietina; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

O rápido desenvolvimento das técnicas de terapia gênica é uma perspectiva promissora para a área da saúde, entretanto, igualmente implica em um risco potencial ao possibilitar novas abordagens não-terapêuticas, como, por exemplo, o melhoramento do desempenho atlético no esporte. Sabe-se que os avanços recentes comprovados em relação a biossegurança e aos benefícios da transferência gênica em humanos, aumentaram a probabilidade de busca do doping genético por atletas e que, além disso, um dos genes exógenos mais prováveis a serem utilizados como alvo é a eritropoietina (EPO. Tendo em vista a inclusão do doping genético no Código Mundial Antidopagem, é de fundamental importância o desenvolvimento de métodos com especificidade e sensibilidade adequadas para sua detecção. Abordagens baseadas no uso de técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são uma alternativa em amostras de sangue, principalmente quando aliados à amostragens não-convencionais, como, por exemplo, a coleta por Dried Blood Spots (DBS). Este é um sistema menos invasivo e de maior robustez, possibilitando um armazenamento e transporte mais estável. Neste trabalho foram analisados 3 diferentes suportes para DBS, visando acoplar os mesmos em um método e detecção para o cenário de controle de dopagem. Duas condições diferentes de temperatura de armazenamento (temperatura ambiente e -30 ºC) e dois períodos de estocagem (1 e 21 dias) foram testados com o objetivo de averiguar o comportamento dos suportes. Amostras de sangue foram coletadas de 6 voluntários saudáveis, fortificadas com material de referência de EPO e tiveram seu DNA extraído. O rendimento foi avaliado por fluorimetria e a pureza dos produtos obtidos por espectrofotometria na região do ultravioleta. Dois ensaios para PCR tendo como alvo diferentes junções éxon/éxon de EPO transgênica foram usados para amplificação, assim como um ensaio para um gene constitutivo. Todas as amostras extraídas apresentaram rendimento, pureza e integridade adequados para um cenário de controle de dopagem. Os melhores rendimentos á - 30 ºC foram obtidos com o papel NUCLEIC-CARD™, enquanto à temperatura ambiente com o suporte Whatman. Para o tempo de 1 dia, não há correlação entre o uso de refrigeração e incrementos positivos nos resultados de extração e/ou detecção. Para o tempo de 21 dias, o mesmo é observado para o Whatman, enquanto os outros dois suportes expressam melhorias no montante de DNA extraído. Estudos futuros para avaliar a implementação de novas abordagens de aplicações não-volumétricas sob os suportes e de novos métodos de confirmação mais sensíveis são necessários. Novas perspectivas de abordagens por PCR multiplex são encorajadas e podem ser aplicados para detecção de múltiplos alvos em amostras de DBS.