Urinary excretion of Pyrrole compounds in rats exposed to 2,5-Hexanedione and co-exposed to 2,5-Hexanedione and N-Acetylcysteine

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Sara Bonucci Alves Borges da, 1992-
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/15561
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
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spelling Urinary excretion of Pyrrole compounds in rats exposed to 2,5-Hexanedione and co-exposed to 2,5-Hexanedione and N-AcetylcysteineToxicologiaNeurotoxicologiaTeses de mestrado - 2014Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014n-Hexane is a solvent that has many uses, either in pure form or as a component of the commercial mixture hexane. Highly purified n-hexane is primarily used as a reagent, frequently used in the chemical and food industries, in the formulation of glues and paints and as a degreasing agent and extract solvent. It is well known that this solvent presents neurotoxic effects, thus, it is very important to study biomarkers, of exposure and/ or effect, as tools of human biomonitoring, acting as indicators of exposure, as well as predictive biomarkers to prevent the occurrence of neurotoxic effects. In this context, it is imperative to understand the mechanism of n-hexane toxicity and identify endpoints that may be selected as predictive biomarkers of neurotoxicity. The principal aim of this work was to develop accurate procedures to quantify biomarkers in urine of rats exposed to 2,5-hexanedione (2,5-HD), the main metabolite responsible for n-hexane neurotoxicity. This γ-diketone reacts with primary amines of lysine in protein neurofilaments, yielding the formation of pyrrole compounds. However, the formed pyrroles may oxidize and react to other protein nucleophiles, inducing the cross-linking between proteins and causing damage to cellular proteins. The most sensitive proteins to this damage are neurofilaments and other cytoskeletal proteins. In fact, the altered cross-linked proteins aggregate in the distal axon, often just proximal to a node of Ranvier, disrupting the normal physiological cellular activities and causing the neurotoxic effect. To accomplish the goal of this dissertation, 2,5-HD was administrated in rats during 12 dosages and the pyrrole concentrations were measured, to assess if there were any difference between the control group and exposed rats. Simultaneously, was studied the role of N-acetylcysteine (NAC) as a possible protective agent of neurotoxic effects evaluating a group of co-exposed rats (2,5-HD+NAC) and a NAC exposed group.A Toxicologia é uma ciência que estuda, entre outros factores, os mecanismos de ação e possíveis efeitos que podem advir da exposição humana a agentes químicos (tóxicos), provocando alterações biológicas no organismo. Esta exposição pode ocorrer através do ar, água, comida, objectos, interferindo diretamente com o ambiente e com o Homem. Neste sentido, o ramo da Saúde Pública aumentou a sua intervenção nesta área, tornando a avaliação da exposição a esses agentes num aspeto de alta importância e prioridade na sua ação, com o intuito de prevenir e/ou minimizar os possíveis riscos/ efeitos na saúde humana, através da criação de protocolos de monitorização biológica ambiental e do estabelecimento de limites (mínimos e máximos) de exposição. O objetivo destes dois tipos de protocolo é aumentar a área de atuação, conjugando a identificação e quantificação dos agentes presentes no local de exposição com a quantificação em diferentes amostras biológicas, para que a avaliação do risco de exposição seja o mais correta possível. Um dos grupos alvo desse estudo são os solventes orgânicos, principalmente devido às características volatilidade e lipofilicidade que intervêm no mecanismo de absorção e deposição destes solventes no organismo humano. Após a exposição, ocorre a absorção destes químicos que são, imediatamente, transportados pelo sangue, até aos órgãos onde ocorre a sua metabolização (principalmente o fígado), dando origem a metabolitos que, posteriormente, serão degradados e excretados do organismo, provocando o aparecimento de alguns sintomas físicos, tais como dormência, perda de sensibilidade. A gravidade destes sintomas/ efeitos está principalmente associada à via de absorção, sendo as alterações neurológicas as mais frequentes (como por exemplo neuropatias, axonopatias, mielinopatias). O n-Hexano é um solvente orgânico, altamente volátil e lipofílico, que tem várias aplicações, seja sob a forma pura ou enquanto componente de uma mistura comercial de hexano. A sua forma altamente purificada é primeiramente usada como reagente, sendo as misturas utilizadas nas indústrias químicas e alimentares, na formação de colas e tintas, como desengordurante e solvente de extração. Da literatura e de estudos anteriores, sabe-se que este solvente é responsável pelo aparecimento de efeitos neurotóxicos (maioritariamente alterações neurológicas), principalmente devido à sua capacidade de acumulação no organismo, sendo, por isso, de grande importância a ação da Saúde Pública na criação/ parametrização de protocolos de controlo e monitorização. Dentro destes protocolos, surgem os estudos realizados com biomarcadores, de exposição e/ ou de efeito, estando os biomarcadores de exposição associados à quantificação do agente químico e respetivos metabolitos e os biomarcadores de efeito associados à avaliação do potencial dos efeitos resultantes da exposição. Ambos poderão ser utilizados como ferramentas de monitorização humana, que atuem tanto como indicadores de exposição ou como biomarcadores preditivos da ocorrência desses efeitos neurotóxicos. O grau de severidade dos efeitos causados está relacionado com a via de exposição, tempo e grau de exposição, podendo afetar várias partes do corpo, como pele, mucosas das membranas, sistema respiratório, fígado, sangue, sistema reprodutivo e sistema nervoso. Assim, com base no referido anteriormente, percebe-se que é fundamental o conhecimento do mecanismo de toxicidade dos agentes e identificação de endpoints que possam ser escolhidos para utilização enquanto biomarcadores de previsão da neurotoxicidade desses agentes. No caso concreto desta dissertação, o agente em causa é o n-hexano que, após ser metabolizado no fígado dos organismos, origina vários metabolitos, sendo a 2,5-Hexanodiona (2,5-HD) um deles e o principal responsável pelos efeitos adversos que decorrem da exposição ao n-hexano. Posteriormente, esta γ-dicetona é distribuída por vários órgãos/ zonas no organismo, reagindo com os vários componentes lá existentes, dos quais se destacam as proteínas associadas ao funcionamento do sistema nervoso. Esta interação é feita através das aminas primárias do aminoácido lisina nas proteínas (dos neurofilamentos dos neurónios), conduzindo à formação dos aductos pirrólicos, que irão desnaturar a proteína o que, consequentemente, a fará perder a sua função, provocando alterações neurológicas e electrofisiológicas. Por outro lado, os pirróis formados podem também oxidar e reagir com outras proteínas nucleofílicas, induzindo a ligação cruzada entre agregados de proteínas no axónio distal, normalmente próximo de um nódulo de Ranvier, o que também irá interferir com o normal funcionamento das atividades celulares fisiológicas. Todas as alterações anteriormente referidas estão associadas à acumulação da γ-dicetona em várias partes do organismo que, por métodos analíticos, pode ser quantificada através de uma reação química entre o 4-Dimetilaminobenzaldeído (componente do reagente de Ehrlich) e o anel pirrólico que se forma após contacto da dicetona com as proteínas. Face a todas estas alterações pode-se ainda falar em possíveis agentes que possam atuar na diminuição e/ ou reversão dos efeitos causados pela dicetona. De entre essas substâncias está a N-Acetilcisteína que, devido às suas propriedades antioxidantes, tem a capacidade de manter os níveis intracelulares de Glutationo (GSH), que ajuda a reduzir a concentração das Espécies Reativas de Oxigénio (ROS) responsáveis tanto por destabilizações celulares e como pela inibição/ atraso na morte celular. No caso concreto dos compostos pirrólicos, parece atuar reduzindo/ impedindo a oxidação do anel pirrólico, que é o passo determinante na formação dos pirróis, na medida em que provoca rutura e alteração das biomoléculas e células do organismo humano. Assim, com o intuito de perceber a extensão das alterações causadas pela exposição do organismo à 2,5-HD, através da quantificação dos pirróis, foram estipulados quatro objetivos para esta dissertação: i) desenvolvimento de procedimentos analíticos que permitissem determinar qual o reagente de Ehrlich e respetivas condições de reação (nomeadamente a temperatura de reação) que apresentassem maior sensibilidade na determinação e quantificação dos pirróis; ii) validação do método previamente escolhido como o mais sensível/ adequado, de acordo com normas e parâmetros já definidos na literatura; iii) determinação da influência da administração (por injeção) de 2,5-HD na concentração dos pirróis, em amostra de urina de ratos Wistar e iv) teste do efeito de proteção da NAC face à formação dos aductos pirrólicos, enquanto agente antioxidante que atua na redução e/ou eliminação dos efeitos resultantes da exposição ao metabolito 2,5-HD. Para o primeiro objetivo, utilizou-se um método espectrofotométrico para quantificação dos pirróis, com base numa reação colorimétrica entre soluções-padrão, de concentrações conhecidas, e o reagente de EH. Experimentalmente foram comparados dois reagentes diferentes, um preparado com trifluoreto de boro e outro com ácido clorídrico, à temperatura ambiente e a 45ºC. Estes estudos foram realizados com o intuito de perceber qual o reagente de EH e a temperatura que permitia uma maior sensibilidade do método e, consequentemente, uma melhor aproximação da verdadeira concentração dos pirróis nas amostras de urina analisadas. Dos resultados obtidos, concluiu-se que o melhor método a utilizar é o reagente de EH com ácido clorídrico, à temperatura ambiente, devido à maior sensibilidade, simplicidade e menor toxicidade, estando esta última característica associada à ausência de trifluoreto de boro, uma substância bastante tóxica. Após a escolha do método a utilizar, procedeu-se à validação, seguindo parâmetros definidos para métodos internos de ensaio em análise química, tais como: linearidade, gama de trabalho, limites de deteção e quantificação, sensibilidade, precisão e exatidão. Nesta parte foi avaliada a curva de calibração determinada para o reagente de EH com ácido clorídrico à temperatura ambiente. Tanto a linearidade como a gama de trabalho são parâmetros que foram analisados estatisticamente, comparando um valor calculado utilizando os resultados obtidos com um valor já definido na literatura e, em ambos os casos, os resultados estavam bem ajustados. De acordo com os resultados obtidos, 2,4966 nmol/ mL é a menor concentração que pode ser detetada nas amostras (limite de deteção) e 3,3810 nmol/ mL a menor concentração possível de ser quantificada utilizando a curva previamente determinada. 0,01876 é um valor que está associado à capacidade do método em distinguir pequenas diferenças entre as concentrações dos analitos. Por fim, dentro da precisão temos a repetibilidade e a precisão intermédia que permitem avaliar a reprodutibilidade do método em condições de variabilidade, tais como laboratórios, analistas, equipamento, tipos de reagentes e duração. A exatidão foi o único parâmetro que não foi avaliado neste trabalho experimental por não haver nenhum valor teórico que se pudesse utilizar para comparação. O cumprimento do terceiro objetivo foi feito através da comparação da concentração dos compostos pirrólicos entre grupos de ratos expostos a diferentes doses de 2,5-HD. As doses foram injetadas por via intraperitoneal, em dias alternados, durante um total de 12 administrações (doses), das quais foram avaliadas as doses 1,4,8 e 12, que estão associadas aos dias de recolha de urina. Da comparação dos resultados obtidos, para o grupo controlo (injeção intraperitoneal de soro fisiológico) concluiu-se que a primeira dose resultou na distribuição da 2,5-HD pelos tecidos, pois os níveis deste composto na urina dos ratos expostos são bastante superiores aos níveis apresentados pelos ratos do grupo controlo. Quanto às outras doses, não foi possível observar se houve diferença significativa, pois i) existe uma grande variabilidade entre os animais, responsável por grandes desvios na análise estatística e ii) devido ao possível surgimento do estado estacionário, em que a determinada altura, a taxa de absorção se torna igual à taxa de eliminação, tornando a concentração dos pirróis constante. Para o quarto e último objetivo desta dissertação, os ratos foram co-expostos à 2,5-HD (injeção intraperitoneal) e NAC (adicionada à água de beber), com o intuito de comparar as concentrações nos dois grupos para testar o possível efeito protetor da NAC, face à injeção de 2,5-HD. Para a primeira dose administrada, foi possível observar que existe um fator protetor quando se adiciona NAC na água de beber que é dada aos ratos, pois a concentração de compostos pirrólicos do grupo co-exposto é inferior à concentração destes mesmos compostos na exposição única a 2,5-HD. Com a continuação da exposição para as restantes doses, o efeito da NAC foi-se tornando menos evidente, o que poderá estar associado ao facto da dose de NAC administrada nos ratos não ser suficiente para reduzir o efeito da exposição repetida à 2,5-HD.Mateus, Maria Luísa Andrade, 1962-Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-Repositório da Universidade de LisboaCosta, Sara Bonucci Alves Borges da, 1992-2014-12-29T18:38:48Z20142014-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/15561TID:201384299enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:02:16Zoai:repositorio.ul.pt:10451/15561Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:36:58.803541Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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