The role of N-terminal phosphorylation on Huntingtin oligomerization, aggregation and toxicity

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Joana Margarida Marques Branco dos, 1987-
Data de Publicação: 2012
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/7554
Resumo: Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2012
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spelling The role of N-terminal phosphorylation on Huntingtin oligomerization, aggregation and toxicityDoença de HuntingtonHuntingtinaEspécies oligoméricasFosforilaçãoSistema BiFCTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2012Huntington’s disease (HD) is a hereditary disorder caused by a mutation in the exon-1 of the IT-15 gene, which encodes for a protein called huntingtin. The N-terminal region of mutant huntingtin is prone to aggregate and is toxic for specific types of neurons in the striatum and cortex, leading to the involuntary movements and psychiatric disturbances that characterize HD. Growing evidence indicates that the smaller, more soluble aggregates (dimers and oligomers) are the most toxic species, but little is still known about the process of huntingtin oligomerization. The aim of this thesis was to elucidate the role of the N-terminal region of huntingtin on its oligomerization, aggregation and toxicity. We put special emphasis on its phosphorylatable residues (T3, S13 and S16), because phosphorylation pathways are involved in key aspects of HD. We used a huntingtin-Venus bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay recently developed in our laboratory. In this model, huntingtin exon-1 is fused to two non-fluorescent halves of the Venus protein (V1 and V2). When huntingtin dimerizes, the two halves get together and reconstitute the functional fluorophore. We used these BiFC constructs to create a series of phosphoresistant (T3A, S13A, S16A) and phosphomimic (T3D, S13D, S16D) huntingtin mutants and test their behavior in living cells. The presence of phosphomimic mutations in both 103QHtt-V1 and 103QHtt-V2 BiFC constructs completely abolished the generation of huntingtin aggregates. Combinations of a non-mutated construct with a phosphomimic construct produced intermediate phenotypes in terms of oligomerization and aggregation. Phosphoresistant BiFC pairs did not produce overt phenotypes. Mutations in N-terminal residues had varied effects on Htt toxicity, which apparently were not associated with the levels of oligomeric species or inclusion bodies. Our results contribute to a better understanding of HD and highlight the therapeutic potential of targeting the phosphorylatable residues of N-terminal huntingtin.A doença de Huntington (HD) é uma doença hereditária causada por uma mutação no exão-1 do gene IT-15, que codifica para a proteína huntingtina. A região N-terminal da proteína mutada tem tendência para agregar e é tóxica para tipos específicos de neurónios no estriado e no córtex, levando ao aparecimento de movimentos involuntários e perturbações psiquiátricas, que caracterizam a doença. Evidências crescentes indicam que os agregados mais pequenos e solúveis (dímeros e oligomeros) representam as espécies mais tóxicas, no entanto, pouco se sabe acerca do processo de oligomerização da huntingtina. O principal objectivo deste trabalho foi elucidar o papel da região N-terminal da huntingtina na sua oligomerização, agregação e toxicidade. Focámo-nos especialmente nos resíduos fosforiláveis (T3, S13 e S16), uma vez que as vias de fosforilação estão envolvidas em aspectos-chave da HD. Foi utilizado um sistema de complementação bimolecular de fluorescência(BiFC), recentemente desenvolvido no nosso laboratório. Neste modelo, o exão-1 da huntingtina é fundido com duas metades não fluorescentes da proteína Venus(V1 e V2). Quando a huntingina dimeriza, as duas metades unem-se, reconstituindo o fluoróforo funcional. Estas ferramentas BiFC foram utilizadas para criar vários mutantes resistentes à fosforilação (T3A, S13A, S16A) e constitutivamente fosforilados (T3D, S13D, S16D), sendo o seu comportamento testado em células vivas. Quando presentes em ambas as metades 103QHtt-V1 e 103QHtt-V2 BiFC, as mutações que imitam a fosforilação, resultaram na abolição de agregados nas células. Combinações de metades BiFC mutadas e não-mutadas produziram fenótipos mistos em termos de oligomerização e agregação. Mutantes BiFC resistentes à fosforilação não produziram fenótipos evidentes. As mutações nos resíduos da região N-terminal evidenciaram efeitos diversos na toxicidade da huntingtina, aparentemente não associados com os níveis de oligomeros ou agregados. Os nossos resultados contribuem para uma melhor compreensão da HD, destacando o potencial alvo terapêutico dos resíduos fosforiláveis da região N-terminal da huntingtina.Outeiro, Tiago Fleming, 1976-Herrera, FedericoRepositório da Universidade de LisboaSantos, Joana Margarida Marques Branco dos, 1987-2013-01-23T11:14:49Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/7554enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:50:51Zoai:repositorio.ul.pt:10451/7554Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:20.730059Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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