Novas estratégias de purificação de microRNAs usando líquidos iónicos
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2018 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10400.6/10075 |
Resumo: | As terapias baseadas em ácidos nucleicos têm tido cada vez mais destaque no tratamento de diversas doenças, nomeadamente em doenças autoimunes, oncológicas e neuro-degenerativas. No entanto, para a utilização destas biomoléculas é necessário que estas estejam integras, puras e que mantenham a sua atividade biológica. Os líquidos iónicos (LIs) são um grupo de sais orgânicos com bastante potencial na purificação de ácidos nucleicos pois apresentam características físico-químicas muito próprias e grande versatilidade para manipular o design do catião/anião. Acrescendo a este facto, alguns LIs são considerados “green solventes”, tornando-se assim uma alternativa mais ecológica aos solventes orgânicos normalmente utilizados. O principal objetivo deste trabalho é investigar a aplicabilidade da cromatografia líquida preparativa, com recurso a uma matriz macroporosa funcionalizada com líquidos iónicos, na purificação de ácidos nucleicos. Para concretizar este objetivo foram extraídos três tipos diferentes de amostra (ARN de baixo peso molecular; ADN genómico e ARN de baixo peso molecular; ADN genómico, ARN ribossomal e ARN de baixo peso molecular) a partir da Escherichia coli DH5a que foram utilizados em ensaios de ligação em modo “batch” onde diferentes líquidos iónicos estavam imobilizados em sílica (S-Sil), usada como fase estacionária. Com estes ensaios foi possível avaliar a capacidade dos diferentes tipos de S-Sils (S-SilPrBenzCl; S-SilPrMImCl; S-SilPrNEt3Cl; S-SilPrMet2ButCl; e S-SilPrN(C8)3Cl) para reconhecer e ligar às diferentes espécies de ácidos nucleicos. Estes ensaios foram realizados repetidamente de modo a ser possível comprovar a sua reprodutibilidade e resistência à regeneração. De uma forma geral os S-Sils demonstraram a possibilidade de promover diversas interações, nomeadamente iónicas e hidrofóbicas, com as diferentes espécies de ácidos nucleicos, dando, no entanto, destaque para S-SilPrNEt3Cl e S-SilPrMet2ButCl uma vez que demonstraram ser ligandos promissores para a aplicação na purificação de ácidos nucleicos. Após os referidos ensaios foi realizada a funcionalização da matriz cromatográfica macroporosa como ligando mais promissor, SilPrNEt3Cl, para a realização dos ensaios de purificação de ADN genómico, ARN ribossomal e ARN de baixo peso molecular. No final, foi possível confirmar a separação das três espécies de ácidos nucleicos num único ensaio cromatográfico. |
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Novas estratégias de purificação de microRNAs usando líquidos iónicosÁcidos NucleicosCromatografiaLíquidos IónicosDomínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências BiomédicasAs terapias baseadas em ácidos nucleicos têm tido cada vez mais destaque no tratamento de diversas doenças, nomeadamente em doenças autoimunes, oncológicas e neuro-degenerativas. No entanto, para a utilização destas biomoléculas é necessário que estas estejam integras, puras e que mantenham a sua atividade biológica. Os líquidos iónicos (LIs) são um grupo de sais orgânicos com bastante potencial na purificação de ácidos nucleicos pois apresentam características físico-químicas muito próprias e grande versatilidade para manipular o design do catião/anião. Acrescendo a este facto, alguns LIs são considerados “green solventes”, tornando-se assim uma alternativa mais ecológica aos solventes orgânicos normalmente utilizados. O principal objetivo deste trabalho é investigar a aplicabilidade da cromatografia líquida preparativa, com recurso a uma matriz macroporosa funcionalizada com líquidos iónicos, na purificação de ácidos nucleicos. Para concretizar este objetivo foram extraídos três tipos diferentes de amostra (ARN de baixo peso molecular; ADN genómico e ARN de baixo peso molecular; ADN genómico, ARN ribossomal e ARN de baixo peso molecular) a partir da Escherichia coli DH5a que foram utilizados em ensaios de ligação em modo “batch” onde diferentes líquidos iónicos estavam imobilizados em sílica (S-Sil), usada como fase estacionária. Com estes ensaios foi possível avaliar a capacidade dos diferentes tipos de S-Sils (S-SilPrBenzCl; S-SilPrMImCl; S-SilPrNEt3Cl; S-SilPrMet2ButCl; e S-SilPrN(C8)3Cl) para reconhecer e ligar às diferentes espécies de ácidos nucleicos. Estes ensaios foram realizados repetidamente de modo a ser possível comprovar a sua reprodutibilidade e resistência à regeneração. De uma forma geral os S-Sils demonstraram a possibilidade de promover diversas interações, nomeadamente iónicas e hidrofóbicas, com as diferentes espécies de ácidos nucleicos, dando, no entanto, destaque para S-SilPrNEt3Cl e S-SilPrMet2ButCl uma vez que demonstraram ser ligandos promissores para a aplicação na purificação de ácidos nucleicos. Após os referidos ensaios foi realizada a funcionalização da matriz cromatográfica macroporosa como ligando mais promissor, SilPrNEt3Cl, para a realização dos ensaios de purificação de ADN genómico, ARN ribossomal e ARN de baixo peso molecular. No final, foi possível confirmar a separação das três espécies de ácidos nucleicos num único ensaio cromatográfico.Nucleic acids-based therapies are indispensable products of a modern society to treat several life-threatening diseases such as cancer, autoimmune, and neurodegenerative diseases. However, these biomolecules must be obtained with highintegrity, -purity and biologically active, foreseeing their use as biopharmaceuticals in the (bio)pharmaceutical industry. Particularly, nucleic acids stability is often hampered by their susceptibility to degradation by nucleases. In this way, emerge the ionic liquids (IL), which are a group of organic salts that present a high potential in the stabilization and purification of nucleic acids. This improved ability results from their specific physical and chemical characteristics, and the large versatility to manipulate the design of the cation/anion. Furthermore, due to their oustanding biodegrability and biocompatibility and low toxicity, some ILs can be classified as green solvents, becoming this way a more ecological and sustainable alternative to the organic solvents usually applied in the purification process. Therefore, this work´s main objective is to investigate the applicability of macroporous-based matrices functionalized with ILs fornucleic acids purification, in the context of preparative liquid chromatography. In order to achieve this objective, three different samples of nucleic acids were extracted (Low molecular weight RNA; genomic DNA and Low molecular weight RNA; genomic DNA, ribosomal RNA and Low molecular weight RNA) from the bacteria Escherichia coli DH5a using appropriate protocols; these samples were then used in binding/elution assays, which were performed in a “batch” mode using immobillized silicas (S-Sil) with different ionic liquids, as stationary phases. These assays evaluated the ability of the different types of S-Sils (S-SilPrBenzCl; S-SilPrMImCl; S-SilPrNEt3Cl; S-SilPrMet2ButCl; e S-SilPrN(C8)3Cl) to recognize and bind the distinct species of nucleic acids. These assays were performed repeatedly in order to demonstrate their reproducibility and resistance to regeneration. In general, the best results were obtained with S-SilPrNEt3Cl and S-SilPrMet2ButCl silicas, indicating that NEt3Cl and Met2ButCl are the most promising ligands for the purification of the different nucleic acids classes. After the mentioned assays, the macroporous matrix was functionalized with the IL SilPrNEt3Cl, yielding the matrix MP-SilPNEt3Cl. Then, this chromatographic matrix was used in purification assays of distinct classes of nucleic acids - genomic DNA, ribosomal RNA and Low molecular weight RNA -, and the separation of the three different classes of nucleic acids was achieved. Overall, the chromatographic matrix MP-SilPNEt3Cl may represent an improvement in the current methodologies used for nucleic acids purification in terms of robustness and selectivity.Sousa, Fani Pereira deFreire, Mara G.uBibliorumRodrigues, Inês Isabel Dias2020-06-20T00:30:15Z2018-07-192018-06-202018-07-19T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.6/10075TID:202354113porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-12-15T09:51:27Zoai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/10075Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T00:50:07.634489Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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