Reappraising the use of beta-lactam antibiotics against tuberculosis: study of genes associated with beta-lactam susceptibility in mycobacteria

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mortinho, Diana da Costa
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/56469
Resumo: Tese de mestrado , Microbiologia Aplicada, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Reappraising the use of beta-lactam antibiotics against tuberculosis: study of genes associated with beta-lactam susceptibility in mycobacteriaTuberculoseResistência a antibióticosCRISPRiPG hidrolaseβ-lactâmicosTeses de mestrado - 2022Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado , Microbiologia Aplicada, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasMycobacterium tuberculosis (Mtb) causes one of the deadliest diseases in the world, tuberculosis (TB). The emergence of Mtb strains that are both multi- and extensively drug-resistant (MDR/XDR) emphasizes the urgent need to create novel drugs and efficient treatment modalities. β-lactams are a bactericidal class of antibiotics frequently used in medical practice and the chosen treatment for a wide range of infections, caused by various pathogens. The rise of MDR-TB has encouraged renewed interest in β-lactam/β-lactamase inhibitor combination therapy. The application of β-lactams still has limitations, with further studies being necessary to prove their clinical benefit. The identification of genomic variants associated with differential susceptibility to β-lactams is particularly relevant for this. A recent study revealed a group of putative genomic markers of differential β-lactam phenotypes, which includes the lpqK (Rv0339c) gene. Moreover, this study uncovered that mutations in peptidoglycan (PG) hydrolase genes like cwlM (Rv3915) that were associated with lower β-lactam minimum inhibitory concentrations (MICs). To understand the role of cwlM and lpqK for a phenotype of susceptibility to β-lactams, knockdown mutants were constructed in the mycobacterial study model, Mycolicibacterium smegmatis (M. smegmatis), using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference (CRISPRi) system. It’s a straightforward and cost-effective platform to repress the expression of genes. Characterization assays of both knockdown mutants confirmed the essentiality of cwlM and the nonessentiality of lpqK and the repression of cwlM impacts the susceptibility of M. smegmatis to cefotaxime and meropenem, while lpqK repression does not. Protein characterization studies revealed that CwlMMtb does not have PG-hydrolytic activity and that LpqKMtb has the highest nitrocefin hydrolysis activity. Synergy assays with β-lactams and CwlMMtb revealed that it hinders the bactericidal activity of cefotaxime against M. smegmatis. These findings contribute significantly to future understanding of mycobacterial pathogenesis and the development of alternative TB therapeutics with β-lactams.Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é o patógeno intracelular que causa uma das doenças mais mortais do mundo, a tuberculose (TB), chegando aos 1,5 milhões de óbitos associados por ano. Normalmente, a TB ativa e Mtb suscetível aos antibióticos tem um tratamento padrão de seis meses com a administração concomitante de quatro agentes antituberculose (isoniazida, pirazinamida, etambutol, rifampicina). As resistências surgem quando os medicamentos anti-TB são usados de forma inadequada, por meio de prescrição incorreta por parte dos profissionais de saúde, baixa qualidade dos antimicrobianos, interrupção das cadeias de transporte e baixa adesão do doente. O aumento de estirpes de Mtb que são multi- e extensivamente resistentes a antimicrobianos (MDR e XDR) enfatiza a necessidade urgente de novos agentes anti-TB e esquemas terapêuticos mais eficientes. O envelope de Mtb é uma estrutura complexa. A estrutura essencial da parede celular é composta por três componentes principais: um polímero reticulado de peptidoglicano (PG), um polissacarídeo altamente ramificado de arabinogalactano (AG) e ácidos micólicos de cadeia longa (MA). Estes componentes formam o complexo micol-arabinogalactano-peptidoglicano (mAGP). Sendo a principal característica do envelope celular micobacteriano, o complexo mAGP é responsável pela resistência inata a muitos antibióticos comumente usados e também está envolvido na virulência de Mtb. As enzimas que catalisam a biossíntese e reciclagem de componentes da parede celular, em particular do PG, são essenciais para a viabilidade de Mtb, e, portanto, são alvos atraentes para o desenvolvimento de novos antibióticos. Os β-lactâmicos são uma classe de antibióticos bactericidas, sendo os antibióticos mais bem validados na prática médica e o tratamento de escolha para uma ampla gama de infeções, causadas por vários patógenos bacterianos. Essencialmente, os β-lactâmicos têm como mecanismo de ação a inibição das transpeptidases do PG. A sua exclusão do tratamento da TB é notável, mas o aumento da MDR-TB estimulou um interesse renovado na terapia combinada de inibidores de β-lactamases com β-lactâmicos. A aplicação de β-lactâmicos no tratamento da TB ainda apresenta limitações, sendo necessários mais estudos para comprovar o seu benefício clínico. Para tal, é crucial entender a patogenicidade e os mecanismos de resistência de Mtb. A identificação de variantes genómicas ligadas à suscetibilidade diferencial aos β-lactâmicos é particularmente relevante para este objetivo. Um estudo recente revelou um grupo de marcadores genómicos putativos envolvidos na resposta aos β-lactâmicos, incluindo o gene lpqK (Rv0339c). Este gene codifica para uma lipoproteína putativa com um domínio β-lactamase. Além disso, os resultados obtidos mostraram que duas mutações num gene de hidrolase do PG, cwlM (Rv3915), estão associadas a menores concentrações mínimas inibitórias (CMIs) para os β-lactâmicos. Para compreender a relação de cwlM e lpqK com um fenótipo de suscetibilidade aos βlactâmicos, neste trabalho foram construídos mutantes de eliminação (knockdown) num modelo de estudo micobacteriano, o Mycolicibacterium smegmatis (M. smegmatis). Como Mtb é um patógeno humano que exige um laboratório de biossegurança de nível três e treino substancial antes do manuseio, traz consigo um risco de exposição acidental e a necessidade do uso de um organismo modelo não patogénico. Estes mutantes foram construídos usando o sistema clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) de interferência (CRISPRi). Este sistema foi otimizado por Rock et al. e é baseado no CRISPRi locus de Streptococcus thermophilus (dCas9Sth1). Para além disso, representa o método mais simples e rápido para regulação da transcrição de genes de interesse em micobactérias. Com uma plataforma de plasmídeo único, tudo o que é necessário para o knockdown do gene é a clonagem de uma região de direcionamento única de ~20 pares de base do RNA guia (sgRNA). O CRISPRi é indutível, permitindo assim a fácil manipulação de genes essenciais. A magnitude do knockdown de CRISPRi é ajustável, variando a "força" do motivo protoespaçador adjacente (PAM) direcionado, no caso da dCas9Sth1, ou variando a concentração de indutor, modulando o grau de complementaridade de sgRNA-alvo ou truncando a região de direcionamento do sgRNA. Finalmente, o CRISPRi pode ser multiplexado, o que é de particular importância em patógenos de crescimento lento, como Mtb em que a manipulação genética é demorada. A viabilidade dos mutantes knockdown de cwlM e de lpqK em M. smegmatis foi verificada através de ensaios de diluição (spotting assays) e confirmamos a essencialidade de cwlM e a não essencialidade de lpqK em M. smegmatis. O knockdown foi posteriormente confirmado por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). A caracterização do fenótipo de suscetibilidade a antibióticos β-lactâmicos e anti-TB foi feita através de ensaios de CMIs. Nestes, conseguimos observar que a repressão de cwlM, afeta a suscetibilidade de M. smegmatis à cefotaxima e ao meropenem, no entanto, a repressão de lpqK não teve qualquer efeito na suscetibilidade aos vários antibióticos. Para além disso, foram feitos spotting assays com cefotaxima e meropenem, e discos de difusão em agar utilizando amoxicilina-clavulanato e meropenem. Estes ensaios foram realizados com apenas o mutante knockdown de cwlM uma vez que foi o único mutante no qual se registaram diferenças nos ensaios CMIs. A partir dos resultados obtidos, em conjunto, foi possível determinar que a repressão de cwlM tem influência no fenótipo de suscetibilidade de M. smegmatis em comparação com a estirpe wild-type, para a cefotaxima e para o meropenem. Um outro objetivo deste projeto foi a caracterização das proteínas CwlM e LpqK de Mtb. A proteína CwlM está anotada com uma N-acetilmuramoil-L-alanina amidase, pertencendo ao grupo das hidrolases, que tem um papel de regulação numa via conservada relacionada com a biossíntese do PG: PknB-CwlM-MurA. Após a indução, extração e purificação da CwlM, foi realizado um zimograma de forma a caracterizar uma possível atividade de hidrólise do PG, no entanto esta proteína não revelou atividade contra o PG de Micrococcus luteus. A proteína LpqK não foi purificada devido a constrangimentos no tempo de realização do projeto. A proteína LpqK é uma lipoproteína com um domínio de β-lactamase, como tal, esta atividade foi medida através de um ensaio de hidrólise de nitrocefina, em estirpes produtoras de ambas as proteínas ao invés de se testar a atividade das proteínas purificadas. Como resultado, foi possível verificar que LpqK tem a maior atividade de hidrólise em comparação com o controlo e que CwlM também tem alguma atividade embora menor que LpqK. Para perceber como a CwlM pode interagir com vários antibióticos em prol de um fenótipo de suscetibilidade/resistência de M. smegmatis, foram realizados ensaios de sinergia entre várias concentrações de CwlM com várias concentrações de cefotaxima, cefotaxima-clavulanato, meropenem e etambutol. Este ensaio revelou que a CwlM causa um atraso evidente no efeito bactericida da cefotaxima e em conjunto com o clavulanato há um efeito semelhante, mas mais reduzido. Esta observação é mais notória para a concentração de proteína mais elevada usada no ensaio em concentrações de antibiótico perto da CMI usual. Para os restantes antibióticos as diferenças não são notórias pois para qualquer concentração de antibióticos ou proteína, os valores de taxa de crescimento são bastante similares. Estes resultados podem dever-se à atividade de amidase que ClwM tem. Usualmente, as β-lactamases agem de forma a cortarem a ligação amida nos β-lactâmicos e a CwlM poderá também estar a cortar essa ligação. Como cada antibiótico β-lactâmico tem uma estrutura diferente, a CwlM pode ter uma afinidade maior na quebra dessa ligação no caso da cefotaxima em comparação com os outros β-lactâmicos usados. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta dissertação ajudou a esclarecer a importância do cwlM e do lpqK na suscetibilidade/resistência de M. smegmatis a antibióticos. Para além disso, foi possível perceber um pouco das características e da importância das proteínas ortólogas em Mtb para a resistência a antibióticos. Os resultados e as conclusões apresentadas poderão ser relevantes para uma melhor compreensão da patogénese de Mtb e contribuir para o desenvolvimento futuro de terapêuticas alternativas para o tratamento de TB. Estas terapêuticas alternativas poderão ser exploradas para amplificar a eficácia dos β-lactâmicos, através do uso de um adjuvante que iniba a ação de determinados alvos. Assim, será possível compreender a utilidade geral dos antibióticos β-lactâmicos na terapêutica da TB e promover a sua utilização contra isolados resistentes a antibióticos específicos.Catalão, Maria JoãoCunha, Mónica VieiraRepositório da Universidade de LisboaMortinho, Diana da Costa2023-02-28T11:16:53Z202220222022-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/56469enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:04:06Zoai:repositorio.ul.pt:10451/56469Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:07:00.913302Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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