Produção de β-galactosidase por levedura recombinante : desenvolvimento de um sistema de produção estável

• Autor(a) principal: Oliveira, Carla Cristina Marques de
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1822/918

A tecnologia do DNA recombinante é uma ferramenta muito utilizada na produção de roteínas em sistemas heterólogos, proteínas essas de elevado valor acrescentado que são, por natureza, produzidas em baixas quantidades. Com este trabalho pretendeu-se construir estirpes floculantes de Saccharomyces cerevisiae que apresentassem uma produção estável de β-galactosidase de Aspergillus niger por integração do gene que codifica para a expressão desta enzima (lacA) nas sequências δ do genoma desta levedura. Foram utilizados dois sistemas de integração distintos. Um deles utiliza como marca de selecção dominante a resistência ao antibiótico G418 e permite a integração de cópias tandem enquanto que o outro sistema utiliza a marca URA3 e a integração é efectuada em diferentes sítios, com uma única cópia em cada sítio. O gene lacA, ladeado pelo promotor e terminador ADH1, foi clonado em ambos os sistemas que foram seguidamente utilizados para transformar as estirpes S. cerevisiae NCYC869-wt (MatαFlo1) e S. cerevisiae NCYC869-A3 (MatαFlo1ura3), respectivamente. Para o primeiro sistema foram testadas concentrações de antibiótico de 0,2 a 1,5 g/l enquanto que para o segundo sistema foram efectuadas 3 rondas de transformação usando sempre a mesma marca de selecção uma vez que o gene URA3 vai sendo eliminado por recombinação das sequências repetidas que o flanqueiam (hisG). Os transformantes foram seleccionados para estudos posteriores pela actividade de β-galactosidase devido à presença de X-gal nas placas selectivas, ou seja, foram seleccionados pela intensidade de cor azul. Ambos os sistemas de transformação permitiram obter transformantes de S. cerevisiae utilizadores de lactose. Independentemente da marca de selecção utilizada, foram observados diferentes níveis de floculação e diferentes níveis de produção de β-galactosidase. Globalmente, os níveis de produção de β-galactosidase foram mais elevados para o primeiro sistema. Os transformantes que susceptibilizaram maior interesse foram caracterizados geneticamente por hibridação Southern. Para o primeiro sistema, foram observados, no máximo, dois sítios de integração usados em simultâneo com cópias tandem e 8 cópias integradas no total, enquanto que para o segundo, após as 3 rondas de transformação e perda do gene URA3, observou-se apenas dois sítios de integração usados em simultâneo correspondentes a 2 cópias integradas. O melhor transformante seleccionado, pertencente ao primeiro sistema (1,5 g/l de G418), apresenta actividade de β-galactosidase em glucose comparável ao sistema de referência, baseado em plasmídeo epissomal (S. cerevisiae NCYC869-A3/pVK1.1), e apresenta estabilidade das inserções após 8 culturas sequenciais com pelo menos 10 gerações cada. Apesar de crescer em lactose como única fonte de carbono e energia, a produção de β-galactosidase, o nível de floculação e a rapidez no consumo de lactose são inferiores à estirpe de referência.