Protein-carbohydrate recognition by the human commensal Bacteroides thetaiotaomicron: expression, purification and preliminary 3D structure solution of highly specific proteins
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | eng |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10362/112052 |
Resumo: | O intestino humano tem um papel importante na digestão, onde hidratos de carbono são digeridos e transformados em ácidos gordos de cadeia curta (SCFAs), cruciais para a saúde humana. As bactérias comensais presentes neste nicho desempenham um papel importante neste processo e são cruciais para manter o equilíbrio nutricional sendo capazes de degradar eficazmente diversos hidratos de carbono como fonte de nutrientes. Estes podem ser obtidos através da nossa dieta ou de glicoproteínas do hospedeiro que revestem o epitélio intestinal. Uma das bactérias predominantes é a bactéria Bacteroides thetaiotaomicron. No genoma desta bactéria, existem conjuntos de genes denominados Polysaccharide utilization loci (PUL), que codificam para proteínas envolvidas na interação específica com hidratos de carbono, tais como módulos não-catalíticos de ligação a hidratos de carbono (CBMs), associados a enzimas catalíticas, e proteínas Starch utilization System D (SusD)-like. A informação sobre estas proteínas está continuamente a ser depositada na base de dados Carbohydrate Active enZymes (CAZy). No entanto, a maioria carece de caracterização estrutural e funcional. O principal objetivo desta tese é a caracterização estrutural de proteínas constituintes de PULs de B. thetaiotaomicron, envolvidas no reconhecimento de hidratos de carbono do hospedeiro, de maneira a compreender a nível molecular a sua especificidade de ligação. Para o conseguir, diferentes CBMs da família 32 (CBM32) e proteínas SusD-like foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli. Os pares CBM32/SusD: Bt0865-CBM32/Bt0866-SusD pertencentes ao PUL 12 e Bt4040-CBM32/Bt4038-SusD pertencentes ao PUL 73, foram produzidos e as proteínas recombinantes purificadas em larga escala. A caracterização estrutural foi efetuada para o Bt4040-CBM32. A estrutura 3D foi determinada com uma resolução máxima de 1,93Å, e revelou um enrolamento em β-sandwich, comum aos membros conhecidos desta família de CBMs. A comparação estrutural com CBM32s caracterizados revelou uma conservação global da estrutura secundária, mas também características estruturais únicas do Bt4040-CBM32, destacando-se a falta de conservação de aminoácidos situados no local de ligação putativo. Esta divergência de sequência, pode explicar as diferenças de especificidade da ligação a hidratos de carbono deste CBM, nomeadamente a especificidade para determinantes fucosilados Lewis A, como consequência de possíveis pressões adaptativas do B. thetaiotaomicron ao seu habitat natural. |
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Protein-carbohydrate recognition by the human commensal Bacteroides thetaiotaomicron: expression, purification and preliminary 3D structure solution of highly specific proteinsBactérias comensaisHidratos de carbonoPolysaccharide utilization lociCBM32SusD-likeExpressão heterólogaCristalografia de raios-XCommensal bacteriaCarbohydratesHeterologous expressionX-ray crystallographyDomínio/Área Científica::Engenharia e TecnologiaO intestino humano tem um papel importante na digestão, onde hidratos de carbono são digeridos e transformados em ácidos gordos de cadeia curta (SCFAs), cruciais para a saúde humana. As bactérias comensais presentes neste nicho desempenham um papel importante neste processo e são cruciais para manter o equilíbrio nutricional sendo capazes de degradar eficazmente diversos hidratos de carbono como fonte de nutrientes. Estes podem ser obtidos através da nossa dieta ou de glicoproteínas do hospedeiro que revestem o epitélio intestinal. Uma das bactérias predominantes é a bactéria Bacteroides thetaiotaomicron. No genoma desta bactéria, existem conjuntos de genes denominados Polysaccharide utilization loci (PUL), que codificam para proteínas envolvidas na interação específica com hidratos de carbono, tais como módulos não-catalíticos de ligação a hidratos de carbono (CBMs), associados a enzimas catalíticas, e proteínas Starch utilization System D (SusD)-like. A informação sobre estas proteínas está continuamente a ser depositada na base de dados Carbohydrate Active enZymes (CAZy). No entanto, a maioria carece de caracterização estrutural e funcional. O principal objetivo desta tese é a caracterização estrutural de proteínas constituintes de PULs de B. thetaiotaomicron, envolvidas no reconhecimento de hidratos de carbono do hospedeiro, de maneira a compreender a nível molecular a sua especificidade de ligação. Para o conseguir, diferentes CBMs da família 32 (CBM32) e proteínas SusD-like foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli. Os pares CBM32/SusD: Bt0865-CBM32/Bt0866-SusD pertencentes ao PUL 12 e Bt4040-CBM32/Bt4038-SusD pertencentes ao PUL 73, foram produzidos e as proteínas recombinantes purificadas em larga escala. A caracterização estrutural foi efetuada para o Bt4040-CBM32. A estrutura 3D foi determinada com uma resolução máxima de 1,93Å, e revelou um enrolamento em β-sandwich, comum aos membros conhecidos desta família de CBMs. A comparação estrutural com CBM32s caracterizados revelou uma conservação global da estrutura secundária, mas também características estruturais únicas do Bt4040-CBM32, destacando-se a falta de conservação de aminoácidos situados no local de ligação putativo. Esta divergência de sequência, pode explicar as diferenças de especificidade da ligação a hidratos de carbono deste CBM, nomeadamente a especificidade para determinantes fucosilados Lewis A, como consequência de possíveis pressões adaptativas do B. thetaiotaomicron ao seu habitat natural.The human intestine has an important role in human digestion where diverse carbohydrates are digested to absorbable short chain fatty acids (SCFAs), crucial for human health. Commensal bacteria within this niche play an important role in this process and are crucial to maintain human nutritional balance by efficiently degrading diverse carbohydrates as sources of nutrients. These are either obtained through our diet or constituents of glycoproteins that cover the intestinal epithelium. A major predominant bacterium is Bacteroides thetaiotaomicron. In the genome of this bacterium, there are gene clusters termed Polysaccharide utilization loci (PUL), which code for proteins involved in the specific targeting of carbohydrate substrates, such as the non-catalytic carbohydrate-binding modules (CBMs), associated with catalytic enzymes, and Starch utilization system D-like proteins (SusD-like). Information about these proteins is continuously being deposited in the Carbohydrate Active enZymes database (CAZy). However, the majority lack structural and functional characterization. The main goal of this thesis was to structurally characterize B. thetaiotaomicron PUL proteins involved in the recognition of host-like carbohydrates to understand at molecular level their carbohydrate-binding specificity. To achieve this, different CBMs of CAZY family 32 (CBM32) and SusD-like proteins were recombinantly expressed in Escherichia coli. Successful expression and purification to homogeneity was achieved for pairs of CBM32/SusD: Bt0865-CBM32/Bt0866-SusD from PUL 12 and Bt4040-CBM32/Bt4038-SusD from PUL 73. Structural characterization was followed up for Bt4040-CBM32. The 3D structure, solved at a maximum resolution of 1.93Å, revealed a β-sandwich fold, common to known members of this family. The structural comparison with characterized CBM32 revealed an overall conservation of the core tertiary structure, but also structural features unique to Bt4040-CBM32, particularly the lack of conservation of amino acid residues in the putative binding site. These differences could account for the distinct binding specificity of this CBM to epitopes containing fucosylated Lewis A determinants and could reflect adaptive pressures on B. thetaiotaomicron from its natural habitat.Palma, Maria Angelina de SáCarvalho, Ana Luísa Moreira deRUNFavinha, André Griffin de Almeida2023-11-30T01:30:47Z2021-01-262021-02-192021-01-26T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10362/112052enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-03-11T04:55:49Zoai:run.unl.pt:10362/112052Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T03:42:04.591070Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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