Protein-carbohydrate recognition by the human commensal Bacteroides thetaiotaomicron: expression, purification and preliminary 3D structure solution of highly specific proteins

• Autor(a) principal: Favinha, André Griffin de Almeida
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/112052
• topic: Bactérias comensais; Hidratos de carbono; Polysaccharide utilization loci; CBM32; SusD-like; Expressão heteróloga; Cristalografia de raios-X; Commensal bacteria; Carbohydrates; Heterologous expression; X-ray crystallography; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia

O intestino humano tem um papel importante na digestão, onde hidratos de carbono são digeridos e transformados em ácidos gordos de cadeia curta (SCFAs), cruciais para a saúde humana. As bactérias comensais presentes neste nicho desempenham um papel importante neste processo e são cruciais para manter o equilíbrio nutricional sendo capazes de degradar eficazmente diversos hidratos de carbono como fonte de nutrientes. Estes podem ser obtidos através da nossa dieta ou de glicoproteínas do hospedeiro que revestem o epitélio intestinal. Uma das bactérias predominantes é a bactéria Bacteroides thetaiotaomicron. No genoma desta bactéria, existem conjuntos de genes denominados Polysaccharide utilization loci (PUL), que codificam para proteínas envolvidas na interação específica com hidratos de carbono, tais como módulos não-catalíticos de ligação a hidratos de carbono (CBMs), associados a enzimas catalíticas, e proteínas Starch utilization System D (SusD)-like. A informação sobre estas proteínas está continuamente a ser depositada na base de dados Carbohydrate Active enZymes (CAZy). No entanto, a maioria carece de caracterização estrutural e funcional. O principal objetivo desta tese é a caracterização estrutural de proteínas constituintes de PULs de B. thetaiotaomicron, envolvidas no reconhecimento de hidratos de carbono do hospedeiro, de maneira a compreender a nível molecular a sua especificidade de ligação. Para o conseguir, diferentes CBMs da família 32 (CBM32) e proteínas SusD-like foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli. Os pares CBM32/SusD: Bt0865-CBM32/Bt0866-SusD pertencentes ao PUL 12 e Bt4040-CBM32/Bt4038-SusD pertencentes ao PUL 73, foram produzidos e as proteínas recombinantes purificadas em larga escala. A caracterização estrutural foi efetuada para o Bt4040-CBM32. A estrutura 3D foi determinada com uma resolução máxima de 1,93Å, e revelou um enrolamento em β-sandwich, comum aos membros conhecidos desta família de CBMs. A comparação estrutural com CBM32s caracterizados revelou uma conservação global da estrutura secundária, mas também características estruturais únicas do Bt4040-CBM32, destacando-se a falta de conservação de aminoácidos situados no local de ligação putativo. Esta divergência de sequência, pode explicar as diferenças de especificidade da ligação a hidratos de carbono deste CBM, nomeadamente a especificidade para determinantes fucosilados Lewis A, como consequência de possíveis pressões adaptativas do B. thetaiotaomicron ao seu habitat natural.