Regulation of the alternative splicing of RAC1b in tumour cells
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/36248 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018 |
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Regulation of the alternative splicing of RAC1b in tumour cellsSplicing alternativoRAC1bESRP1RANBP2Cancro colorretalTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018A expressão génica é o mecanismo pelo qual a informação codificada num gene é convertida num produto funcional. A regulação deste processo permite que as células expressem genes diferencialmente consoante o seu tipo, fase de desenvolvimento ou mesmo em resposta a estímulos externos. Portanto, através da regulação da expressão génica, as células conseguem ativar genes seletivamente dependendo das suas necessidades e funções. Um dos processos cruciais envolvidos neste processo regulatório é o splicing do pré-mRNA, que consiste na remoção dos intrões e junção dos exões numa sequência codificante contígua. Esta reação de splicing é catalisada pelo spliceossoma, um complexo ribonucleoproteico que reconhece e interage com as sequências de consenso nos limites dos exões e dos intrões, de forma a direcionar a excisão dos intrões e a ligação dos exões do RNA. Na maioria dos genes humanos a inclusão ou exclusão dos exões no transcrito final ocorre de forma diferencial, tornando-se assim possível a produção de múltiplos mRNAs diferentes a partir de um único gene. Este processo é denominado de splicing alternativo e é um dos mecanismos que modula a regulação da expressão proteica e a produção de um proteoma complexo e diversificado em eucariotas mais complexos. Durante o processo de splicing alternativo a decisão de qual exão é removido e qual é incluído no mRNA final, para além das sequencias de consenso é também fortemente influenciada pela interação entre elementos regulatórios cis e os fatores trans. Os elementos cis ocorrem tanto nas regiões exónicas como nas regiões intrónicas e podem promover a inclusão do exão através do recrutamento do spliceossoma (sequências promotoras) ou promover a sua exclusão por interferência com a ligação do spliceossoma às sequências de consenso (sequências silenciadoras). As sequências promotoras são, geralmente, ligadas por fatores que atuam em trans positivos, como é o caso das proteínas SR, enquanto que as sequências silenciadoras são normalmente ligadas por fatores que atuam em trans negativos, como é o caso das proteínas hnRNPs. Para além da presença de elementos regulatórios cis e fatores trans, uma variedade de outros fatores podem influenciar o splicing alternativo, como é o caso da presença de estruturas secundárias no mRNA, da presença de microRNAs, da arquitetura dos exões e intrões, da força relativa das sequências de consenso no local de splicing e ainda da velocidade de elongação durante a síntese do pré-mRNA pela RNA polimerase II. A soma das contribuições de cada um destes elementos define o potencial de reconhecimento de um exão e a sua respetiva afinidade pelo spliceossoma. Devido ao seu papel central na expressão e função de proteínas, é expectável que problemas ao nível da regulação do splicing alternativo possam resultar no desenvolvimento de doenças. Um exemplo disso é a sobreexpressão da variante de splicing hiperativa do gene RAC1, RAC1b, em diversos tumores malignos. A variante RAC1b é caracterizada pela inserção de um exão (exão 3b) extra entre os exões 3 e 4 de RAC1. Estes 19 aminoácidos extra codificados pelo exão 3b, para além de uma regulação diferente também conferem uma seletividade na sinalização a jusante de RAC1b. Esta variante promove a produção de ROS e a via de sinalização do NF-kB em detrimento de outras vias clássicas ativadas por RAC1, promovendo a progressão do ciclo celular e a sobrevivência das células. Em cancro colorretal, a variante RAC1b encontra-se sobre expressa num subgrupo específico de tumores que também apresentam uma mutação oncogénica em BRAF (BRAFV600E), tendo sido demonstrado a existência de uma cooperação entre estes eventos no sentido de promover a sobrevivência das células tumorais. Até agora, sabe-se que o splicing alternativo de RAC1 é regulado por duas proteínas SR, SRSF1 e SRSF3. SRSF1 promove a inclusão do exão alternativo 3b, ao contrário de SRSF3 que promove a sua exclusão. Ambos os fatores são regulados por vias de sinalização a montante, nomeadamente, os níveis proteicos de SRSF1 aumentam quando a via de sinalização PI3K é inibida, enquanto que a via β-catenin/TCF4 estimula a expressão de SRSF3. É provável que existam outros elementos que regulem o splicing alternativo de RAC1, e recentemente, as proteínas PTBP1 e ESRP1 foram descritas como possíveis modeladoras deste evento em diferentes tipos de células, enquanto que a nucleoporina RANBP2 foi relacionada com a distribuição de proteínas SR fosforiladas, as quais são responsáveis pela regulação da expressão de RAC1b. Neste trabalho experimental foram estudados estes três possíveis modeladores do splicing alternativo de RAC1 em células colorretais. Para estudar estes possíveis novos mecanismos de regulação da expressão de RAC1b em células colorretais, começámos por construir vetores de expressão para PTBP1 e ESRP1, sendo que o vetor de expressão para RANBP2 já se encontrava disponível no laboratório de acolhimento. Posteriormente, os possíveis efeitos da sobreexpressão de PTBP1, de ESRP1 e de RANBP2 no splicing alternativo de RAC1 foram determinados através do uso de um minigene RAC1. Basicamente, cada plasmídeo que codificava as proteínas em estudo foi co-transfetado em células com o minigene RAC1. Os resultados foram observados através de um RT-PCR semi-quantitativo, com primers específicos para os transcritos RAC1 e RAC1b derivados do minigene RAC1. A expressão endógena de RAC1b foi também avaliada por Western blot (WB) através do uso de um anticorpo específico contra RAC1b. De acordo com os resultados, os efeitos significativos que foram observados para ESRP1 e RANBP2 foram confirmados ao nível endógeno, através do uso de siRNAs comercialmente disponíveis de forma a silenciar a sua expressão. Os resultados foram mais uma vez obtidos através de um RT-PCR semi-quantitativo, mas desta vez os primers utilizados foram específicos para os transcritos endógenos. Os níveis proteicos de RAC1b endógeno foram também avaliados através de WB. As experiências foram realizadas principalmente em células epiteliais normais do cólon, NCM460, mas confirmadas com células HeLa e HT29 para determinar se os resultados observados eram dependentes da linha celular. A localização celular das proteínas transfetadas foi visualizada através de ensaios de imunofluorescência em células NCM460 e HeLa. A sobreexpressão de PTBP1, nas células NCM460, não afetou significativamente a inclusão do exão 3b no transcrito final. No entanto, a sobreexpressão de ESRP1 e de RANBP2 promoveu a exclusão do exão 3b. As experiências de imunofluorescência mostraram que a expressão de PTBP1 e ESRP1 ocorre tanto no núcleo como no citoplasma, enquanto que a localização de RANBP2 se restringe essencialmente à membrana nuclear. Esta observação vai de encontro com o esperado, dado que PTBP1 e ESRP1 são ambos fatores de splicing, enquanto que RANBP2 faz parte do complexo do poro nuclear. Nas células NCM460, o silenciamento de ESRP1 diminuiu a expressão endógena de RAC1b, enquanto que a depleção de RANBP2 levou ao aumento de RAC1b. O efeito da depleção de ESRP1 no splicing de RAC1 não corroborou os resultados obtidos nas experiências de sobreexpressão, dando assim a indicação de que este fator de splicing, devido ao seu papel na manutenção do fenótipo epitelial, pode ser altamente regulado por um mecanismo de feedback negativo, no qual regula a sua própria expressão. Os resultados obtidos para as células HeLa e HT29 seguiram a mesma tendência observada nas células NCM460. Assim, no geral, o silenciamento de ESRP1 diminuiu a expressão endógena de RAC1b, enquanto que a depleção de RANBP2 levou ao seu aumento, ambos independentemente da linha celular utilizada, sugerindo que tanto ESRP1 como RANBP2 são reguladores gerais da expressão de RAC1b. Em conclusão, esta tese forneceu fortes evidências de que ESRP1 e RANBP2 estão envolvidos na regulação da expressão de RAC1b e identificou pela primeira vez outros fatores, para além de SRSF1 e de SRSF3, envolvidos na regulação da expressão de RAC1b em células colorretais. Mais experiências são necessárias para esclarecer como é que estas proteínas estão a regular o splicing alternativo de RAC1. Este conhecimento será útil na caracterização dos mecanismos de regulação de splicing alternativo de RAC1 e, eventualmente, para desenvolver moduladores farmacológicos eficazes que possam restaurar a sinalização normal de RAC1 em células tumorais.Regulation of gene expression allows cells to differentially express genes in different cell types, developmental stages or even in response to external conditions. Alternative splicing is a crucial regulatory process in the pathway of gene expression and the mechanism by which multiple protein isoforms can be generated from a single gene. This way, complex organisms can regulate protein expression and generate a more diverse proteome from a given gene number within the genome. Due to its central role in modulating gene expression, it is not surprising that aberrant regulation of alternative splicing is associated with human disease. On example is the selective overexpression of a hyperactive splice variant of the RAC1 gene, RAC1b, in several malignant tumours. RAC1b promotes reactive oxygen species production and the NF-kB pathway activation, but not other classical RAC1 signalling pathways, and stimulates cell cycle progression and cell survival. In colorectal cancer, RAC1b was found to be overexpressed in a specific subgroup, namely in 80% of tumours with mutation in the oncogene BRAF, suggesting that both events cooperate to promote the survival of colorectal cells. Previous studies in colorectal cells showed that the splicing factor SRSF1 acts as an enhancer of RAC1 alternative splicing by promoting the inclusion of alternative exon 3b, while SRSF3 acts as a silencer by promoting the skipping of the exon 3b. Besides SRSF1 and SRSF3 it is likely that RAC1 alternative splicing can be regulated by additional factors, and recently, PTBP1 and ESRP1 were described as possible modulators of the alternative splicing of RAC1b in different cell types while RANBP2 was shown to be a modulator of the distribution of phosphorylated SR proteins, which are known to regulate RAC1b expression. To study whether these factors regulate RAC1b expression in colorectal cells, we started by analysing the effects of PTBP1, ESRP1 and RANBP2 overexpression on RAC1 alternative splicing. For that, each expression vector encoding the proteins in study was co-transfected with the RAC1 minigene into cells. The results were then assessed through a semi-quantitative RT-PCR, with specific primers for RAC1 and RAC1b transcripts derived from the RAC1 minigene. Effects on endogenous RAC1b expression was also assayed by Western blot and cellular localization of the transfected proteins assessed by immunofluorescence. Positive effects were then confirmed at the endogenous protein level through the use of commercially available siRNAs to deplete the regulators. The experiments were mainly performed in NCM460 colon cells but confirmed using HeLa and HT29 cells to determine if the observed results were cell line dependent. As expected, immunofluorescence experiments showed that both PTBP1 and ESRP1 can be found in the nucleus and cytoplasm, while RANBP2 is found at the nuclear membrane and also at the cytoplasm. RANBP2 overexpression was found to promote the skipping of the alternative exon 3b, while its depletion promoted exon 3b inclusion. Thus, RANBP2 emerged as a candidate negative regulator of RAC1 alternative splicing that promotes the skipping of exon 3b. In the case of ESRP1, both overexpression and depletion promoted the skipping of the alternative exon 3b. ESRP1 overexpression might interfere with a negative feedback mechanism, in which ESRP1 regulates its own expression, due to its role in maintaining the epithelial phenotype. Based on the depletion experiment, ESRP1 can also be considered a candidate positive regulator of RAC1 alternative splicing, which promotes the inclusion of exon 3b, unlike RANBP2. No significant effect of PTBP1 on RAC1 alternative splicing was observed. In conclusion, this thesis provided strong evidence that ESRP1 and RANBP2 are involved in RAC1b expression regulation and identified for the first time other factors besides SRSF1 and SRSF3 that are involved in the regulation of RAC1b expression in colorectal cells. Further experiments are needed to clarify how these proteins are regulating RAC1 alternative splicing. This knowledge will be useful to characterize RAC1 alternative splicing regulation mechanisms and eventually to develop effective pharmacological modulators that can restore normal RAC1 signalling in tumour cells.Jordan, Peter M.Gonçalves, Vânia Marina Cristóvão,1980-Repositório da Universidade de LisboaRodrigues, Cláudia Alexandra da Silva2020-10-28T01:30:17Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/36248TID:202189023enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:32:46Zoai:repositorio.ul.pt:10451/36248Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:32.849777Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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