Genetic Analysis of Patients with Frontotemporal Dementia and Generation of induced Pluripotent Stem Cells and Brain Organoids

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Neves, Mafalda Teixeira Vaz das
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/10316/111390
Resumo: Dissertação de Mestrado em Genética Clínica Laboratorial apresentada à Faculdade de Medicina
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spelling Genetic Analysis of Patients with Frontotemporal Dementia and Generation of induced Pluripotent Stem Cells and Brain OrganoidsAnálise Genética de Pacientes com Demência Frontotemporal e Estabelecimento de Células Estaminais Pluripotentes Induzidas e de Organoides CerebraisFrontotemporal DementiaGenetic Analysisinduced Pluripotent Stem CellsCortical Brain Organoidsin vitro modelsDemência FrontotemporalAnálise GenéticaCélulas estaminais pluripotentes induzidasOrganoides cerebrais corticaismodelos in vitroDissertação de Mestrado em Genética Clínica Laboratorial apresentada à Faculdade de MedicinaFrontotemporal Dementia (FTD) is a neurodegenerative disorder characterized by changes in behavior, attention, executive function, and language, involving the frontal and temporal lobes. It is the second most common form of dementia in patients under the age of 65. Between 20% – 50% of cases have a positive family history and one third of those have an autosomal dominant pattern of inheritance. The prevalence of FTD varies by region and age group, and the overall incidence appears to be similar in men and women. There are three main genes responsible for causing FTD. The most common mutation is on chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72), followed by mutations in progranulin (GRN) and microtubule-associated protein tau (MAPT).One problem that has hampered the study of neurodegenerative diseases, especially FTD, is the lack of good disease models. Mouse models have been the most used model for the past decade, and have tried to understand and recapitulate the pathological mechanisms and molecular changes underlying the clinical features of the disease in vivo. However, these systems focus on a specific protein or genetic mutation and lack a full complement of human glial complexity, vascular and immunological components. This limits the extent to which these models can accurately recapitulate what happens in patients with FTD. Thus, the advent of reprogramming fibroblasts into iPSCs and the generation of brain organoids hold great promise as the most valuable model to date to study FTD, since they can model the earliest pathological changes of the disease and allow the study of the molecular mechanisms behind mutation driven cellular failure, in the case of iPSCs, while simultaneously allowing the study of cell-cell interactions between different populations and modelling the effects of specific genetic backgrounds, in the case of brain organoids.Therefore, the aims of this study were: to characterize patients with FTD from a genetic point of view and subdivide them according to their mutation status; establish novel iPSCs lines derived from patient skin fibroblasts and use these iPSCs to generate an in vitro model of the disease; and finally, to generate brain organoids to model the pathological human brain of patients with FTD.The results obtained showed that one patient (patient #007) carries a GRN mutation and two other patients (patient #006 and patient #011) carry the C9ORF72 expansion. Furthermore, iPSCs lines were successfully established and more than one colony was generated for each patient. The iPSC lines expressed the expected pluripotency markers and were able to originate cells from different embryonic leaflets. The two patients carrying the C9ORF72 expansion expressed both endogenous OCT4 and episomal vector-derived OCT4 and only endogenous SOX2. Brain organoids from patient #007 were successfully generated shown to express Ki-67, vimentin, β3-tubulin and MAP2 at day 25, which illustrates their ability to commit to a neuronal fate. Further validation of more mature organoids using different assays is still required to validate these models as reliable models for FTD.Thus, a multidisciplinary team worked together during the course of this project to generate these new in vitro models, capable to recapitulate the neuropathologic changes of FTD patients. A wide variety of techniques and procedures were developed and optimized to generate and characterize the patient derived brain organoids from skin biopsies. Overall, the positive validation of these new models will not only open new avenues for the study of the underlying mechanisms of FTD, but also pave the way for drug screening of new therapeutic approaches and for novel opportunities for personalized medicine.A Demência Frontotemporal (DFT) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por alterações no comportamento, atenção, função executiva e linguagem, envolvendo os lobos frontal e temporal. É a segunda forma mais comum de demência em doentes com menos de 65 anos. Entre 20% a 50% dos casos têm uma história familiar positiva e um terço destes apresenta um padrão de hereditariedade autossómico dominante. A prevalência da DFT varia consoante a região e a faixa etária, sendo que a incidência global é semelhante entre homens e mulheres. Existem três genes principais responsáveis por causar DFT. A mutação mais comum é no quadro de leitura aberto 72 do cromossoma 9 (C9ORF72), seguida de mutações na progranulina (GRN) e na proteína tau associada aos microtúbulos (MAPT).Um dos problemas que dificulta o estudo das doenças neurodegenerativas, especialmente a DFT, é a falta de bons modelos de doença. Os modelos de rato têm sido o modelo mais utilizado na última década e têm tentado recapitular os mecanismos patológicos e as alterações moleculares subjacentes às características clínicas da doença in vivo. No entanto, estes sistemas centram-se numa proteína específica ou numa mutação genética e carecem de um complemento completo da complexidade glial humana e dos componentes vasculares e imunológicos. Isto limita a extensão na qual estes modelos podem recapitular com precisão o que acontece nos pacientes com DFT. Assim, o advento da reprogramação de fibroblastos em iPSCs e a geração de organoides cerebrais são promissores como modelos mais valiosos para estudar a DFT, uma vez que podem modelar as primeiras alterações patológicas da doença e permitir o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes à falência celular causada por mutações, no caso das iPSCs, permitindo simultaneamente o estudo das interações célula-célula entre diferentes populações e modelar os efeitos de antecedentes genéticos específicos, no caso dos organoides cerebrais.Assim, os objetivos deste estudo foram: caraterizar os doentes com DFT do ponto de vista genético e subdividi-los de acordo com a sua mutação; estabelecer novas linhas de iPSCs derivadas de fibroblastos e utilizar estas iPSCs para gerar um modelo in vitro da doença; e, finalmente, gerar organoides cerebrais de modo a modelar o cérebro humano patológico de pacientes com DFT.Os resultados obtidos mostram que um dos três pacientes (paciente #007) é portador de uma mutação no gene da GRN e os outros dois pacientes (pacientes #006 e #011) são portadores da expansão no C9ORF72. Além disso, as linhas de iPSCs foram estabelecidas com sucesso e foi gerada mais do que uma colónia para cada paciente. As linhas de iPSCs expressaram os marcadores de pluripotência esperados e foram capazes de originar células de diferentes folhetos embrionários. Os dois pacientes portadores da expansão no C9ORF72 expressaram tanto OCT4 endógeno como OCT4 derivado do vetor epissomal e apenas SOX2 endógeno. Organoides cerebrais do paciente #007 foram gerados com sucesso, tendo sido demonstrado que expressam Ki-67, vimentina, β3-tubulina e MAP2 ao dia 25, o que ilustra a sua capacidade de se comprometerem com um destino neuronal. É ainda necessária uma validação adicional destes organoides mais maduros utilizando diferentes ensaios para validar estes modelos como modelos fiáveis para a DFT.Assim, uma equipa multidisciplinar trabalhou em conjunto no decorrer deste projeto para gerar estes novos modelos in vitro, capazes de recapitular as alterações neuropatológicas dos doentes com DFT. Foi desenvolvida e otimizada uma variedade de técnicas e procedimentos para gerar e caraterizar os organoides cerebrais derivados de biópsias de pele de pacientes. Globalmente, a validação positiva destes novos modelos não só abrirá novas perspetivas para o estudo dos mecanismos subjacentes à DFT, como também para o rastreio de novas abordagens terapêuticas e para novas oportunidades de medicina personalizada.FCT2023-10-232025-10-22T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/111390https://hdl.handle.net/10316/111390TID:203447794engNeves, Mafalda Teixeira Vaz dasinfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-01-09T01:21:21Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/111390Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T01:30:47.806519Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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