Application and verification of Next-Generation Sequencing (NGS) for the molecular diagnostics of brain tumours

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pinto, Maria de Azevedo
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/35999
Resumo: Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
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spelling Application and verification of Next-Generation Sequencing (NGS) for the molecular diagnostics of brain tumoursBrain tumoursGliomaMolecular diagnosticsMutationNext-Generation Sequencing (NGS)Mestrado Integrado - 2017Ciências da SaúdeTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Primary brain tumours are a critical cause of morbidity and mortality in both adults and children, representing around 1-2% of all newly diagnosed tumours and accounting for about 2% of all cancer-related deaths. Gliomas are the most prevalent primary malignant brain tumour representing 80% of these. Over the past years, distinctive genetic profiles have been identified in several glioma types which have led to the WHO 2016 new classification of CNS tumours that incorporates molecular parameters into the tumour classification criteria, breaking with the previous approach based entirely on histological features. This refines tumour diagnostics and can also provide important prognostic and therapeutic response information. The aim of this study was to apply and verify if Next-Generation Sequencing (NGS) can effectively replace the classical methods – pyrosequencing and Sanger sequencing - in establishing the molecular diagnostics of gliomas. Thus, a glioma-tailored gene panel covering 518 amplicons of 19 genes frequently aberrant in gliomas was designed and applied to assess 30 glioma samples. This targeted NGS approach was carried out by Illumina® TruSeq® technology in Illumina® MiSeq System. DNA libraries preparation showed a success rate of 90%. Data analysis was performed using several bioinformatical software and filtering parameters of variants were optimized to reduce sequencing artefacts in the NGS run. Better DNA quality libraries presented more reliable results showing less DNA sequence changes. The sensitivity and specificity of the 19-gene panel for detection of DNA sequence variants were verified by single-gene analyses which showed to be substantial concerning hotspot mutations but not so trustworthy concerning new-mutations detected by NGS. The presented findings showed that, even though NGS application in routine glioma molecular diagnostics can’t be yet implemented, further investigation of this technology is promising since NGS showed to be a resourceful tool for glioma genetic profiling, displaying its potential as diagnostic method which would facilitate the integrated histological and molecular glioma classification.Os tumores cerebrais primários são uma causa crítica de morbilidade e mortalidade em adultos e crianças, representando cerca de 1-2% de todos os tumores recém-diagnosticados e cerca de 2% de todas as mortes relacionadas com o cancro. Os gliomas são o tipo de tumor cerebral maligno primário mais prevalente representando 80% destes. Ao longo dos últimos anos, foram identificados perfis genéticos distintivos em vários tipos de glioma o que levou à nova classificação de tumores do SNC de 2016, pela OMS, que incorpora os parâmetros moleculares nos critérios de classificação do tumor, quebrando com a abordagem anterior inteiramente baseada nas características histológicas. Esta nova abordagem veio aperfeiçoar o diagnóstico dos tumores e a capacidade de fornecer, também, informações importantes quanto ao prognóstico e resposta à terapêutica. O objetivo deste estudo foi aplicar e verificar se a Sequenciação de Nova Geração (NGS) pode efetivamente substituir os métodos clássicos - pirosequenciação e sequenciação de Sanger - no estabelecimento do diagnóstico molecular dos gliomas. Assim, foi desenhado e aplicado um painel genético adaptado a gliomas que cobriu 518 amplicões de 19 genes frequentemente aberrantes nestes, para analisar 30 amostras de gliomas. Esta abordagem direcionada da NGS foi realizada pela tecnologia TruSeq da Illumina®, no seu sistema MiSeq. A preparação das bibliotecas de DNA mostrou uma taxa de sucesso de 90%. A análise dos dados foi realizada recorrendo a vários softwares bioinformáticos e os parâmetros de filtração das variantes obtidas foram otimizados para reduzir os artefactos da sequenciação resultantes da execução da NGS. As bibliotecas de DNA de melhor qualidade apresentaram resultados mais confiáveis exibindo menos alterações nas sequências de DNA. A sensibilidade e a especificidade do painel de 19 genes para a deteção de mutações foram verificadas por análise individual dos genes, indicando ser substanciais em relação às mutações hotspot, mas não tão confiáveis em relação às novas mutações detetadas pela NGS. Os resultados apresentados mostraram que, apesar de não ser possível implementar para já a NGS na rotina do diagnóstico molecular de gliomas, é promissora uma investigação adicional nesta tecnologia, uma vez que a NGS mostrou ser uma ferramenta rica em recursos para delinear o perfil genético dos gliomas, ilustrando o seu potencial como método de diagnóstico que facilitaria a classificação histológica e molecular integrada dos gliomas.Waha, AndreasCastro, Rui EduardoRepositório da Universidade de LisboaPinto, Maria de Azevedo2020-12-14T01:30:14Z2017-12-1420172017-12-14T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/35999enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:32:20Zoai:repositorio.ul.pt:10451/35999Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:20.992064Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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