Modelling phenotypic resistance to ampicillin in a Petri dish
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/40379 |
Resumo: | Tese de mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 |
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Modelling phenotypic resistance to ampicillin in a Petri dishResistência a antibióticosAmpicilinaProdução de β-lactamasePersistênciaTransconjugantesTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Desde o início da década de 1940 que o uso massivo de antibióticos por parte dos seres humanos tem selecionado bactérias resistentes em todo o mundo. Atualmente, este é um dos maiores problemas que a medicina moderna está a enfrentar. A resistência é uma característica hereditária que permite às bactérias sobreviverem mesmo quando se encontram na presença de antibióticos em concentrações acima das que são suportadas por bactérias ditas suscetíveis. Existem três processos principais de resistência a antibióticos: (i) bactérias capazes de fazer a remoção do antibiótico do interior da célula para o meio extracelular (através de bombas de efluxo); (ii) bactérias capazes de transformar o alvo dos antibióticos, impedindo a interação entre ambos; e (iii) bactérias capazes de produzir enzimas que degradam o antibiótico. O foco deste trabalho é neste último mecanismo de resistência, mais especificamente na produção de enzimas β-lactamase por parte de bactérias E. coli. Estas enzimas são capazes de causar a disrupção do anel β-lactâmico característico de alguns tipos de antibióticos, como por exemplo a ampicilina e a penicilina. Uma vez desfeito este anel, os antibióticos perdem o seu efeito. Em bactérias gram-negativas, estas enzimas encontram-se maioritariamente no espaço periplasmático. Contudo, através de mecanismos de dispersão, estas enzimas são libertadas, difundindo-se pelo espaço extracelular. Este espalhamento resulta na degradação do antibiótico nas redondezas das células resistentes. Uma vez degradado o antibiótico, bactérias suscetíveis que estejam na vizinhança podem conseguir sobreviver e crescer. O processo de resistência indireta foi descrito pela primeira vez há mais de 50 anos. Modelos matemáticos e, mais recentemente, experiências in vitro, demonstraram que bactérias E. coli produtoras de β-lactamase têm a capacidade de proteger células sensíveis. Estes estudos foram realizados tanto com plasmídeos artificiais como com plasmídeos naturais codificantes para a enzima β-lactamase. Domingues et al. (2017) estudaram as condições ecológicas ideais para que bactérias sensíveis se consigam aproveitar da presença de bactérias resistentes produtoras de β-lactamase e sobreviver, apesar da presença inicial de antibiótico. Quantificaram o número de bactérias resistentes e o número de bactérias sensíveis, após 24h co-cultivadas em meio suplementado com antibiótico. Em diversas condições, foi observado um crescimento de células sensíveis. O mecanismo pelo qual as bactérias resistentes degradam o antibiótico, permitindo que após algum tempo as bactérias sensíveis se encontrem num meio destoxificado, é bem conhecido. Contudo, inicialmente, as bactérias sensíveis estão expostas a doses letais de antibiótico. O processo que lhes permite sobreviver nessas condições não é totalmente compreendido. Uma possível explicação é a de que as bactérias sensíveis sejam capazes de entrar num estado de persistência. Nesse estado, as bactérias sensíveis são capazes de parar o seu crescimento, não se dividindo. Uma vez que os antibióticos apenas afetam células que estão em processo de divisão celular, as bactérias persistentes são capazes de sobreviver na sua presença. O fenómeno de persistência é diferente do de resistência a antibióticos. Ao contrário das bactérias resistentes, as bactérias persistentes não são capazes de crescer durante a exposição ao antibiótico. Além disso, o antibiótico é letal para as bactérias suscetíveis que deixem o estado de persistência num meio onde ainda exista antibióticos. Assim sendo, estas bactérias só serão capazes de sobreviver se, enquanto estiverem sem se dividir, o meio for destoxificado. O tempo que uma bactéria permanece em estado de persistência é diferente de bactéria para bactéria. A persistência é uma característica fenotípica apenas de uma pequena percentagem de uma população de bactérias suscetíveis. Assim, uma população com exposição contínua a antibiótico, apresentará uma curva de morte com duas fases distintas. Uma primeira fase em que existe uma taxa de morte elevada devido ao maior número de bactérias que não estão no estado de persistência. Uma segunda fase em que as bactérias em estado de persistência dominam a população, e por isso a taxa de morte será mais reduzida porque apenas morrem as bactérias que vão deixando o estado de persistência. Com este trabalho pretendemos compreender melhor os fenómenos que estão associados à resistência indireta a antibióticos. Com base nos resultados experimentais obtidos por Domingues et al. (2017), simulamos o crescimento bacteriano de células resistentes e sensíveis, co-cultivadas em meio estruturado e suplementado com antibiótico, recorrendo à linguagem computacional R. Nas nossas simulações consideramos que, inicialmente, existe o mesmo número de bactérias (tanto sensíveis como resistentes) que aquelas que foram utilizadas experimentalmente, e que estas completaram tantas gerações quantas as completadas experimentalmente pelas bactérias produtoras de β-lactamase (resistentes ao antibiótico). É possível obter este número de gerações uma vez que as bactérias produtoras se dividem desde o momento inicial, mesmo na presença de antibiótico. Este procedimento permite-nos avaliar os resultados finais quanto ao número de sensíveis, através da comparação das quantidades obtidas experimentalmente e computacionalmente. Nas simulações temos dois parâmetros variáveis: (i) espalhamento da β-lactamase; (ii) quantidade de sensíveis que se começa a dividir em cada geração. Fazendo variar estes parâmetros nas simulações e comparando com os resultados experimentais obtidos por Domingues et al. (2017), foi possível compreender os fatores envolvidos na sobrevivência de bactérias suscetíveis. Este trabalho permite-nos inferir que a destoxificação do meio por parte das bactérias produtoras de β-lactamase é bastante eficiente. Em alguns casos, a difusão da β-lactamase atinge distâncias de até 30 vezes o tamanho da própria bactéria. Para além disto, prevemos que as bactérias sensíveis podem estar em estado de persistência por mais de 5 horas. Por vezes, algumas bactérias só recomeçam a divisão celular depois de outras bactérias sensíveis se encontrarem em crescimento exponencial. Estes resultados foram observados mesmo em condições de alta densidade, o que indica que as bactérias podem permanecer em estado de persistência mesmo depois do sinal de stress (antibiótico neste caso) ser removido. Os resultados computacionais permitiram desenhar curvas de crescimento tanto das bactérias sensíveis como das bactérias produtoras, para os casos em que experimentalmente houve sobrevivência de bactérias sensíveis. A análise das curvas de crescimento permite-nos inferir que a quantidade de β-lactamase produzida pelas bactérias resistentes influencia a geração em que as bactérias sensíveis começam a crescer. Para níveis maiores de produção de β-lactamase, como é o caso de bactérias portadoras do plasmídeo RP4, verifica-se crescimento de bactérias sensíveis logo nas primeiras gerações. No entanto, quando as bactérias suscetíveis são co-cultivadas com bactérias portadoras de plasmídeos com uma menor capacidade de produção de β-lactamase, como é o caso do R1, este crescimento é mais tardio. Interessantemente, vimos que a capacidade de produção de β-lactamase influencia também a frequência na qual se observa o início de crescimento de bactérias sensíveis mais cedo. Uma maior capacidade de produção desta enzima leva a um início de crescimento mais rápido quando existe uma maior percentagem de sensíveis (1R:99S). Contrariamente, se a produção de β-lactamase é menos eficaz, o início do crescimento de bactérias sensíveis acontece mais cedo para os casos em que há uma maior percentagem de bactérias resistentes produtoras da enzima (99R:1S). Colocámos a hipótese de que este fenómeno possa estar associado ao facto de que, para plasmídeos com menor produção de β-lactamase, seja necessário um maior número de bactérias resistentes para haver uma destoxificação eficiente do meio. Por último, mas não menos importante, a comparação dos resultados computacionais com os resultados experimentais sugeriram que as bactérias transconjugantes (i.e., que receberam os plasmídeos codificantes para β-lactamase) podem ter um forte impacto no número de suscetíveis que são protegidas. Esta conclusão deve-se às diferenças nas frequências em que se observa um maior número de sensíveis finais, considerando alta densidade. Estas diferenças são apenas observadas para plasmídeos com maior taxa de conjugação (RP4 e R16a) e não para o plasmídeo R1 (que tem uma taxa de conjugação mais baixa) nem para o pBR322, que é um plasmídeo não conjugativo. Estudos futuros, considerando a transferência de plasmídeos no modelo, poderão permitir uma melhor compreensão da influência deste processo na proteção de bactérias suscetíveis a crescer na presença de antibiótico. Com todas as limitações que necessariamente têm este tipo de simulações, podemos concluir que a comparação dos seus resultados com os obtidos de forma experimental nos permitem, afinal, obter uma “visão microscópica” do que se passa ao nível de cada célula. Desta forma foi possível compreender, por exemplo, quantas bactérias entram no estado de persistência e durante quanto tempo, algo talvez impossível de quantificar usando técnicas puramente experimentais.Antibiotics are commonly used to treat infectious diseases. The constant use of these drugs have selected resistant bacteria and nowadays, antibiotic resistance bacteria are one of the major threats to human health. In this project, we focus on one of the main antibiotics’ resistance mechanisms: production of enzymes that degrade the antibiotics. This mechanism can lead to indirect resistance since upon antibiotic degradation, susceptible bacteria in the neighborhood of resistant ones can benefit from the detoxification of the environment. Recent works have demonstrated this type of resistance, showing that E. coli carrying different plasmids that codify for β-lactamase-production are able to detoxify the environment and protect susceptible cells. However, it is not clear why susceptible cells do not die while the medium is still toxic. Based on experimental results, we use computational methods to simulate the co-culture of susceptible and resistant cells in a structured medium supplemented with ampicillin. Our simulations suggest that resistant bacteria are very effective in detoxifying their surroundings and allowed to estimate the number of persistant cells among susceptible bacteria. Lastly, we make inferences about the effect of the transconjugants in the survival of more susceptible bacteria.Dionísio, Francisco,1971-Repositório da Universidade de LisboaRebelo, João Santos2022-10-30T00:30:39Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/40379TID:202374351enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:39:38Zoai:repositorio.ul.pt:10451/40379Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:54:05.927891Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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