Unveiling the modulation of SAMHD1 in the differentiation of follicular helper T cells and the impact of HIV infection

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Moura, Rita Diniz de
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/53938
Resumo: Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022
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spelling Unveiling the modulation of SAMHD1 in the differentiation of follicular helper T cells and the impact of HIV infectionCélulas T foliculares (Tfh)VIH-1VIH-2SAMHD1Diferenciação de células T folicularesTeses de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infecciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022O vírus da imunodeficiência humana (VIH) pode ser dividido no tipo 1 (VIH-1) e tipo 2 (VIH-2), ambos podendo provocar síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA). Apesar da introdução da terapia antirretroviral, o tratamento não é suficiente para erradicar a infeção por VIH devido ao estabelecimento de latência viral nas células alvo, particularmente em célu las T CD4+. A subpopulação de células T CD4+ foliculares (Tfh) foram identificadas como importantes reservatórios de VIH-1 e VIH-2, revelando níveis elevados de DNA viral em com paração com células CD4+ não-Tfh, mesmo em fases mais precoces do desenvolvimento (pre cursoras de Tfh, pre-Tfh). Assim, a biologia das Tfh pode ajudar a compreender a suscetibili dade à replicação viral. Tfh apresentam um papel único nos centros germinativos (GC) dos órgãos linfoides secundários onde interagem com células B promovendo a sua maturação e a produção de anti corpos. Tfh são fenotipicamente caracterizadas pela expressão de CXCR5, PD-1, ICOS, CXCR4 bem como Bcl-6. Bcl-6 é o fator de transcrição responsável pela diferenciação de cé lulas Tfh, um processo multifatorial que se inicia com a ativação das células T CD4+ naïves pelas células dendríticas (DCs). Esta ativação ocorre através da interação com o recetor de cé lulas T (TCR) e pelo complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHCII), com esti mulação adicional de moléculas co-estimuladoras, como CD28, ICOS e OX40, e citoquinas, como IL-6 e IL-12. Em conjunto com IL-1β e TGF- β, estas moléculas fornecem sinais às cé lulas para diferenciarem-se em células Tfh promovendo a expressão de Bcl-6. Com a expressão de Bcl-6 ocorre a indução dos marcadores PD-1 e CXCR5, e diminuição da expressão de CCR7, que promove a migração das células pre-Tfh para a fronteira T-B. Na zona T-B ocorre a inte ração das Tfh com as células B que vai levar à maturação das células B e das células Tfh. Por sua vez, as células Tfh aumentam os níveis de expressão dos marcadores CXCR5, PD-1 e Bcl 6, e começam a expressar IL-21, possibilitando a migração das mesmas para os folículos das células B e assim para o desenvolvimento do GC. As células Tfh no GC são fenotipicamente caracterizadas por níveis elevados de CXCR5, ICOS, PD-1, BCl-6, e CXCR4 e podem expres sar CD57. Durante este processo, as células Tfh podem sair do GC e transitar para os folículos próximos ou sair do compartimento para o sangue periférico. Diversos fatores foram evidenciados para explicar a elevada suscetibilidade das células Tfh à infeção por VIH: os níveis elevados de expressão de CXCR4, o coreceptor do VIH; o seu estado de ativação e estado de proliferação de acordo com a expressão de ki67; a sua proximi dade às DCs foliculares que podem ser a principal fonte de virões VIH nos GC; a sua localiza ção nos órgãos linfoides secundários que poderá estar associada com a reduzida eficácia da terapia antirretroviral, bem como a reduzida frequência de células T CD8 citotóxicas. Para além disso, o fator de transcrição Bcl-6, essencial para a diferenciação de Tfh, demonstrou ter um impacto na suscetibilidade das Tfh à infeção, quer relacionado com a transcrição viral, quer com a supressão da expressão de genes estimulados por interferão (ISG), que levam à modula ção da expressão de fatores de restrição de VIH. Um destes fatores de restrição é SAMHD1 (do inglês Sterile alpha motif and histidine aspartic acid domain-containing protein-1) que reduz os níveis de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) afetando a transcrição reversa, e dessa forma limita a infeção por VIH-1. SAMHD1 pode ser identificado na maioria dos tecidos, apesar de haver variação dos níveis de expressão de acordo com o tipo de células. Células não-replicativas como macrófagos, células mieloides, DCs ou células T CD4+ quiescentes possuem níveis elevados de SAMHD1, tornando-as menos permissivas à infeção por VIH-1. Já as células T CD4+ ativadas demonstram níveis reduzidos de SAMHD1, sendo mais suscetíveis à replicação do VIH-1. Contrariamente ao VIH-1, o vírus VIH-2 é capaz de modular diretamente SAMHD1 através da sua proteína acessória Vpx que promove a degradação proteossomal de SAMHD1. Embora tenha sido reportado que as Tfh expressam níveis reduzidos de SAMHD1 nos centros germinativos, não existe evidência relativamente aos níveis de SAMHD1 durante a di ferenciação de Tfh, e sobre a sua possível contribuição da elevada capacidade das células pré Tfh suportarem a infeção viral. Deste modo, o presente estudo visou estudar a relação entre SAMHD1 e a diferenciação de Tfh bem como o impacto da infeção por VIH. De modo a avaliar a expressão proteica de SAMHD1 em diferentes estádios de matura ção de Tfh, células mononucleadas isoladas de amígdalas (TMNCs, do inglês tonsillar mono nuclear cells) foram caracterizadas através de citometria de fluxo. Utilizando análises supervisionadas e não-supervisionadas observou-se heterogeneidade a nível da expressão de SAMHD1 ex vivo entre células Tfh (CXCR5+Foxp3- ) de amígdalas. Foi possível identificar diferentes populações de Tfh SAMHD1low e SAMHD1hi em diferentes estágios de diferencia ção, possuindo níveis distintos de expressão de marcadores associados a células Tfh como CXCR5, PD-1, ICOS, CXCR4, Bcl-6, OX40, e CD57. Estes resultados sugerem que as diversas populações de Tfh que podem apresentar diferentes suscetibilidades à infeção viral, em paralelo com possíveis diferentes funções no centro germinativo. Para compreender se a modulação de SAMHD1 impacta a diferenciação das células Tfh, otimizámos um modelo in vitro de diferenciação de Tfh baseado em estudos previamente publicados. Uma vez que a proteína viral Vpx de VIH-2 promove a degradação de SAMHD1, o VIH-2 foi utilizado para avaliar o impacto da expressão de SAMHD1 na diferenciação celu lar. Para tal, células T CD4+ naïve foram isoladas por separação magnética a partir de amostras de sangue de dadores saudáveis e estimuladas com DynaBeads CD3/CD28, e posteriormente infetadas com isolados primários de VIH-1 e VIH-2. Após 4 horas de infeção, o meio foi subs tituído e as células foram novamente estimuladas com D-CD3i/D-CD28s, e cultivadas durante três dias com uma mistura de citoquinas humanas recombinantes (Mix) para promover a dife renciação de Tfh: IL-12, IL-1E, IL-6 e TGF-E. Como controlo, células estimuladas e não esti muladas foram mantidas em cultura apenas com IL-2. Ao dia 5 do ensaio, a estimulação foi removida e um novo meio com as respetivas citoquinas foi adicionado às células. O fenótipo foi analisado por citometria de fluxo aos dias 1, 2, 5 e 7. Confirmámos que células estimuladas, tanto na presença de IL-2 ou da Mix, revelaram aumento da expressão dos marcadores de ati vação CD69 e CD25, bem como de marcadores de diferenciação como CXCR3 e CD45RO. Como esperado, o nosso ensaio revelou uma perda do marcador associado a células naïve (CD45RA) acompanhado com o número de divisões celulares avaliadas por CTV (CellTrace Violet). Relativamente aos marcadores CXCR5 e PD-1, a expressão revelou ser maior nas cé lulas mantidas em cultura com a Mix. Estes dados sugerem que o nosso sistema foi capaz de gerar células Tfh. A expressão de SAMHD1 ao longo da diferenciação in vitro foi avaliada por citometria de fluxo tendo sido aplicadas análises supervisionadas e não-supervisionadas usando UMAP (do inglês, Uniform Manifold Approximation and Projection). Confirmámos a expressão ele vada de SAMHD1 nas células naïves purificadas que foram estimuladas com DynaBeads CD3/CD28. Ao dia 5 após estimulação do TCR, o UMAP demonstrou a transição de células naïve para CD45RO+, com aumento da expressão dos marcadores CD25, ICOS e OX40, sendo ao dia 7 claro o aumento dos marcadores de diferenciação (CXCR3, CXCR5, PD-1) e diminu ição de SAMHD1. Os nossos resultados revelaram um trajeto de diferenciação, muito seme lhante entre diferentes dadores e na presença das diferentes condições testadas, nomeadamente no que respeita à adição de citoquinas e infeção. Além disso, identificámos uma população Tfh definida pela expressão de CD45RO, CXCR5, PD-1, e Bcl-6 e é SAMHD1low. Estes dados revelam que o nosso ensaio promoveu a diferenciação celular e diferenciação de Tfh. No contexto da infeção, verificou-se que tanto VIH-1 como VIH-2 foram capazes de infetar no nosso sistema in vitro. O número de cópias de DNA viral foi semelhante para os dois vírus ao dia 5, havendo um aumento mais marcado do dia 5 para o dia 7 na infeção VIH-1 do que na infeção VIH-2. Este aumento pode dever-se a uma menor taxa de replicação do VIH-2 quando comparado com VIH-1. Ao analisarmos o impacto da infeção nos níveis de SAMHD1, os nossos dados demonstraram uma diminuição da expressão de SAMHD1 na infeção por VIH 2, sendo mais pronunciado em células com menos divisões. Ao avaliar o impacto da infeção na diferenciação de células T CD4+, observámos uma expansão de células CXCR5+ na condição VIH-2 quando comparado com VIH-1, apesar deste aumento não ser significativo. Além disso estes mesmos dados foram observados em células SAMHD1low. Estes dados sugerem que SAMHD1 pode ter impacto na diferenciação de Tfh. Em conclusão, o nosso estudo suporta um impacto das interações vírus-hospedeiro ao longo da diferenciação de Tfh com possíveis implicações na patogénese do VIH.Although antiretroviral therapy (ART) can control Human Immunodeficiency Virus (HIV) replication, ART does not eradicate latently HIV-infected cells. Follicular helper CD4 T (Tfh) cells, a specialized subset of CD4 lymphocytes involved in B cell help, have been shown to be important HIV reservoirs, for both HIV type 1 (HIV-1) and type 2 (HIV-2). Differentiated Tfh cellslocated in the germinal centers (GC) of the secondary lymphoid organs (SLOs) display high levels of CXCR5, PD-1, ICOS, CXCR4 and Bcl-6. Bcl-6, the master regulator of Tfh differentiation, has been reported to impact Tfh susceptibility to HIV infection, through modu lation of HIV restriction factors. One of these restriction factors is SAMHD1 which limits HIV 1 infection by impairing reverse transcription. Unlike HIV-1, HIV-2 can directly counteract SAMHD1 through its accessory protein Vpx that targets SAMHD1 for proteasomal degrada tion. While it is known that Tfh express low levels of SAMHD1, it remains unknown when this is achieved. Therefore, this study aimed to evaluate SAMHD1 expression during Tfh differen tiation and its possible impact on HIV susceptibility. Our results showed heterogeneity of SAMHD1 levels within tonsillar human Tfh cells. Both SAMHD1low and SAMHD1hi cells were found within CXCR5+ populations expressing different levels of ICOS, PD-1 and Bcl-6, as well as markers associated with maturation and GC migration, including OX40, CD57 and CXCR4. These data support the existence of distinct Tfh populations with different susceptibilities to infection. Furthermore, we optimized an in vitro model of Tfh cell differentiation to investigate the SAMHD1 dynamics and the HIV impact. Interestingly, we observed an expansion of SAMHD1low cells upon HIV-2 infection with a trend to higher Tfh frequency. These observa tions might indicate a potential role of SAMHD1 in Tfh differentiation. In conclusion, our study provides new insights about the viral-host interaction along Tfh cell differentiation with possi ble implications in HIV pathogenesis.Santos, Ana Catarina Godinho dosSousa, Ana Espada deRepositório da Universidade de LisboaMoura, Rita Diniz de2022-05-102025-05-10T00:00:00Z2022-05-10T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/53938TID:203008596enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:14Zoai:repositorio.ul.pt:10451/53938Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:04:56.060173Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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