Efeito do 17-beta-estradiol na expressão da transtirretina e da metalotioneína 1-2 numa linha celular de plexo coroideu de rato

• Autor(a) principal: Costa, Marta Isabel Nunes
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/3877
• topic: Transtirretina - Doença de Alzheimer; Metalotioneína - Doença de Alzheimer; Plexo coroideu; Estradiol - Doença de Alzheimer; Transfecção; Doença de Alzheimer - Estrogéneos; Domínio/Área Cientifica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química

O envelhecimento progressivo das populações dos países ocidentais, tem vindo a agravar a incidência de patologias neurodegenerativas, nomeadamente da doença de Alzheimer (AD). Esta patologia caracteriza-se pela deposição extracelular de fibrilhas do péptido β amilóide (Aβ) no córtex cerebral, levando à degeneração das células nervosas circulantes. A transtirretina (TTR), sintetizada principalmente no fígado e plexos coroideus (CPs), parece sequestrar o Aβ, prevenindo a formação dos agregados amilóides. As metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixo peso molecular cuja expressão parece estar alterada em cérebros com AD. O aumento da expressão de MT-1/2 e a diminuição de MT-3 em doenças neuroinflamatórias tem suscitado um interesse crescente no papel destas proteínas na patogénese da AD. O reconhecimento das funções da MT-1/2 na captação de espécies reactivas de oxigénio (ROS), na viabilidade neuronal e no controlo da concentração de iões metálicos envolvidos na agregação amilóide, tem reforçado o interesse da proteína na neurodegeneração e neuroprotecção. Contudo, dados recentes indiciam que a MT-1/2 pode comprometer a remoção de Aβ, ao interagir com a TTR. Nesta perspectiva, o esclarecimento dos mecanismos que controlam os níveis de TTR e de MT-1/2 nos CPs pode prestar um contributo valioso ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas e de diagnóstico para a AD. Com este trabalho pretendeu-se avaliar o efeito de uma hormona com conhecidos efeitos neuroprotectores, o estradiol (E2,) na expressão de TTR e de MT-1/2 nos CPs, recorrendo a uma linha celular de CP de rato (RCP). Foi ainda objectivo deste trabalho optimizar as condições de transfecção das linhas celulares RCP, com Lipofectamine 2000TM, e HEK 293, pelo método do CaCl2, com o intuito de estabelecer metodologias práticas e eficazes para futuros estudos. As culturas da linha celular RCP foram estimuladas com várias concentrações de E2 (0, 1, 10, 100 e 1000nM) durante 6, 12, 24 e 36h. Os extractos proteicos das células foram analisados por Western blot para avaliar os níveis de expressão de TTR e de MT-1/2. Nas células tratadas com E2, os níveis de expressão de TTR aumentaram às 12h de estímulo com hormona a 10 e 100nM (p< 0,05). O efeito da hormona esteróide foi máximo às 24h de estímulo com E2 a 10nM (p< 0,001), sendo os níveis de proteína aproximadamente 2 vezes mais elevados que nas células não estimuladas. Relativamente ao efeito da hormona na expressão de MT-1/2, os resultados revelaram aumentos significativos às 12h de estímulo para todas as concentrações de hormona testadas. 24h após o estímulo hormonal, a expressão de MT-1/2 permaneceu significativamente elevada, comparativamente ao controlo (0nM), sendo o efeito atenuado às 36h de estímulo. Posto isto, conclui-se que o E2 regula positivamente a expressão de TTR e MT-1/2 na linha celular RCP e este efeito pode constituir um mecanismo importante subjacente ao efeito neuroprotector da hormona. As experiências efectuadas para a optimização da transfecção em HEK 293 com CaCl2 mostraram que o pH e concentração dos tampões, a densidade celular e a concentração de plasmídeo são parâmetros críticos no processo de transfecção. Obteve-se uma eficiência de transfecção entre os 40 e os 60%, usando 5μg de plasmídeo, CaCl2 a 300mM, tampão HBS 2x pH 7,05 e uma densidade celular entre os 60-80%. No caso da transfecção na linha RCP com Lipofectamine 2000TM terão que se testar mais condições para optimizar a técnica.