The role of hypoxia driven adenosinergic pathway in the malignant features of bladder cancer cells

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pereira, Maria Margarida Ribeirinho
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/93875
Resumo: Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
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spelling The role of hypoxia driven adenosinergic pathway in the malignant features of bladder cancer cellsO PAPEL DA VIA ADENOSINÉRGICA NAS CARACTERÍSTICAS MALIGNAS DE CÉLULAS DE CANCRO DA BEXIGA EM CONDIÇÕES DE HIPOXIACarcinoma da bexigaHipóxiaAdenosinaEcto-nucleotidasesReceptores da adenosinaBladder cancerHypoxiaAdenosineEcto-nucleotidasesAdenosine receptorsDissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaIntrodução: A hipóxia é uma característica comum dos tumores sólidos e desempenha um papel crítico nas neoplasias malignas, incluindo o cancro da bexiga (CB). O factor induzível por hipóxia-1α (HIF-1α) desempenha um papel importante na regulação da resposta das células tumorais sujeitas ao stress hipóxico que resulta em alterações metabólicas e na ativação de mecanismos de sobrevivência. As células hipóxicas sobreexpressam as ecto-nucleotidases CD39 e CD73 que estão envolvidas na geração de adenosina extracelular. Este nucleosídeo atua como um importante regulador de processos inflamatórios em condições fisiológicas mas no cancro, inibe o sistema imunitário permitindo que as células cancerígenas escapem ao controlo do sistema imunitário. Além disso, existem evidências que associam a ativação da via adenosinérgica em resposta à hipóxia com a agressividade tumoral. No entanto, os mecanismos que estão subjacentes a este processo não estão completamente clarificados.Objetivo: Explorar o papel patofisiológico da via adenosinérgica mediada por hipóxia nas características malignas do CB e avaliar a contribuição do HIF-1α e da adenosina nesses processos biológicos.Métodos: Duas linhas celulares humanas de CB, UM-UC3 e HT-1376, foram expostas a hipóxia usando um sistema anaeróbio GasPakTM EZ na ausência e na presença do inibidor do HIF-1α (Digoxina). A expressão do HIF-1α, CD39, CD73, dos receptores de adenosina A2A e A2B e do PD-L1 foi avaliada por Western blot. Os níveis extracelulares de adenosina no sobrenadante foram medidos usando um kit comercial de medição de adenosina. A proliferação celular e a quimiossensibilidade à cisplatina foram avaliadas pelo ensaio de WST-1. A migração celular foi determinada pelo ensaio de scratch. Os marcadores de superfície e os fatores de transcrição da transição epitelial-mesenquimal foram analisados por qPCR. Estas experiências foram realizadas em condições de normóxia na presença de adenosina.Resultados: Ambas as linhas celulares em condições de hipóxia estabilizaram o HIF-1α e ativaram a via adenosinérgica como demonstrado pela sobreexpressão das ecto-nucleotidases CD39 e CD73, produção de adenosina extracelular e sobreexpressão do receptor A2B. A hipóxia diminuiu a susceptibilidade das células de CB à cisplatina e aumentou a expressão do PD-L1, antecipando o desenvolvimento de mecanismos de evasão do sistema imunológico. A hipóxia induziu a transição epitelial-mesenquimal em ambas as linhas celulares e aumentou a capacidade de migração das células HT-1376, mas não das UM-UC3. O tratamento com adenosina exacerbou as características malignas das células de CB, semelhante às induzidas pelas condições de hipóxia. A Digoxina atenuou a expressão de HIF-1α nas células de CB em condições de hipóxia sem contudo prevenir a produção de adenosina extracelular e os seus efeitos pro-tumorais.Conclusão: A hipóxia ativou a via adenosinérgica nas células de CB e promoveu a agressividade tumoral ao interferir com a proliferação celular, quimiorresistência e capacidade de invasão. A adenosina desempenha um papel importante no efeito pro-tumoral da hipóxia. Assim sendo, estratégias terapêuticas incorporando inibidores da via hipóxia-CD39-CD73-A2BR podem ser benéficos no controlo da progressão tumoral e na resposta à terapia.Introduction: Hypoxia is a common feature of solid tumors and a critical hallmark of malignant disease, including bladder cancer (BC). The hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) is a crucial regulator of cancer cells response to hypoxia stress and results in metabolic changes and activation of survival mechanisms. Hypoxic cells upregulate the ecto-nucleotidases CD39 and CD73 that are involved in the generation of extracellular adenosine. This nucleoside in physiological conditions acts as an important regulator of inflammatory processes but in cancer, dampen the immune system allowing cancer cells to escape the immune control. Moreover, accumulating evidences suggest a link between the adenosinergic response to hypoxia and tumor aggressiveness. However, the mechanisms behind this process are not completely clarified.Objectives: To explore the pathophysiological role of the hypoxia-driven adenosinergic pathway on the malignant features of BC and to unravel the contribution of HIF-1α and of adenosine in those biological processes.Methods: Two human BC cell lines, UM-UC3 and HT-1376, were exposed to hypoxia using the GasPak ez anaerobe system in the absence and in the presence of a HIF-1α inhibitor (Digoxin). The expression of HIF-1α, CD39, CD73, adenosine receptors A2A and A2B and of PD-L1 were measured by Western blot. Extracellular levels of adenosine in supernatants were measured using an adenosine assay kit. Cell proliferation and chemosensitivity to cisplatin were evaluated using the WST-1 assay. Cell migration was assessed via a wound-healing assay. Epithelial-to-mesenchymal transition surface markers and transcription factors were detected by qPCR. A parallel set of experiments were conducted under normoxic conditions in the presence of adenosine.Results: Both cell lines under hypoxic conditions stabilized HIF-1α and activated the adenosinergic pathway as shown by the upregulation of CD39, CD73 and extracellular generation of adenosine, accompanied by an upregulation of the A2B receptor. Hypoxia impaired the susceptibility of BC cells to cisplatin and upregulates the expression of PD-L1, anticipating the development of an immune escape mechanism. Hypoxic stress induced epithelial-to-mesenchymal transition in both cell lines and increased the migratory rate of HT-1376 cells, but not of UM-UC3 cells. Treatment with adenosine exacerbated the malignant features of BC cells in a fashion similar to those induced by hypoxic conditions. Digoxin attenuated the protein expression of HIF-1α in BC cells under hypoxic conditions without preventing the extracellular production of adenosine and its pro-tumoral effects.Conclusion: Hypoxia activated the adenosinergic pathway in BC cells and promoted tumor aggressiveness by interfering with cell proliferation, chemoresistance and invasiveness. Adenosine has a high contribution to the tumor-promoting effects of hypoxia. Therefore, therapeutic strategies incorporating inhibitors of the hypoxia-CD39-CD73-A2BR pathway might be beneficial in controlling tumor growth and response to therapy.Outro - This work was funded by National Funds via FCT (Foundation for Science and Technology) through the Strategic Project UIDB/04539/2020 and UIDP/04539/2020 (CIBB)2020-12-10info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/93875http://hdl.handle.net/10316/93875TID:202686370engPereira, Maria Margarida Ribeirinhoinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-05-25T10:21:21Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/93875Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:12:44.475889Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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