Characterization of the impact of prophages in Helicobacter pylori strains dynamics and biofilm formation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Ricardo João Lopes de
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/59476
Resumo: Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022
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spelling Characterization of the impact of prophages in Helicobacter pylori strains dynamics and biofilm formationHelicobacterProfagosEvoluçãoBiofilmesEnzibióticosTeses de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022Helicobacter pylori é bactéria Gram-negativa microaerofilica bacilar com uma forma helicoidal, medindo entre 2 a 4 μm de comprimento e 0,5 a 1 μm de largura. H. pylori foi isolada, primeira vez em 1983. Estima-se que H. pylori colonize cerca de 50% da população. É um patógeneo estritamente humano, sendo que a infeção ocorre normalmente durante a infância. A prevalência da infeção varia de acordo com a localização geográfica e fatores socioeconómicos, sendo mais elevada em regiões com baixo rendimento familiar. Diversas doenças gástricas são causadas por H. pylori: gastrite crónica sempre que existe infeção, úlceras pépticas em cerca de 20% dos casos, cancro em aproximadamente 1% do casos e Linfomas de MALT em menos de 1% dos casos. Em 1994, H. pylori foi a primeira bactéria ser categorizada como carcinogéneo do grupo 1 pela Agência Internacional para a Investigação do Cancro, da Organização Mundial da Saúde. Para além desta integração na lista de carcinogénicos, H. pylori apresenta frequentemente resistência à claritromicina e à levofloxacina, o que contribui para um nível de cura de apenas 56%. Como tal, a bactéria integra a lista prioritária de patógeneos para investigação e desenvolvimento de novos antibióticos da Organização Mundial da Saúde. H. pylori possui vários fatores de virulência, como VacA e CagA, que contribuem para sua alta especificidade e patogenicidade para com o estômago humano. É importante realçar que H. pylori é uma bactéria naturalmente competente, que possui uma grande diversidade alélica e genética, resultado de vários eventos de recombinação, mutação, rearranjo do genoma e transferência horizontal de genes (HGT). Embora, vários estudos tenham como objetivo estudar a microevolução do H. pylori in vivo e in vitro, nenhum estudo evolutivo de longa duração foi realizado. Vários profagos foram identificados no genoma de estirpes de H. pylori, que parecem compartilhar um processo coevolutivo com o H. pylori. No entanto, a presença consistente de profagos nos genomas de H. pylori ao longo do tempo, bem como o impacto dos profagos na evolução de H. pylori permanece amplamente desconhecido Neste estudo, relatamos a análise genómica da evolução de três estirpes de H. pylori, com e sem profagos, ao longo de várias gerações in vitro. Os genomas das estirpes de H. pylori, no início e no final do ensaio de evolução, foram comparados usando ferramentas bioinformáticas. No genoma da estirpe Hp_5771G foram encontradas um total de 91 mutações após cerca de 121 gerações (passagem #12).No genoma da estirpe Hp_J99, um total de 14 mutações foram encontradas após cerca de 148 gerações (passagem #17). Finalmente, na estirpe Hp_10222C, após cerca de 192 gerações (passagem #19), foram encontradas um total de 6 mutações. Foram identificados vários polimorfismos únicos e múltiplos em nucleótidos de genes que codificam proteínas de membrana, proteínas de interação com o hospedeiro e proteínas de transdução e replicação de DNA. O estudo evolutivo apresenta algumas limitações, sobretudo a utilização de culturas puras de H. pylori, eliminando a verdadeira complexidade do nicho natural do H. pylori. Relatamos uma taxa de mutação por ano e por base entre 3.35E-07 e 5.24E-06 para as estirpes analisadas. Importante realçar que a taxa de mutação tornou-se menor à medida que mais gerações foram estabelecidas. Curiosamente, nenhuma mutação foi identificada na sequência do profago, o que pode significar uma estabilização desta sequência no genoma das estirpes. No fim do estudo evolutivo, as estirpes ancestrais e as evoluídas foram comparadas através de um ensaio de produção de biofilmes ao longo de 5 dias. Todas as estirpes de referência (Hp_J99 e Hp_26695), foram classificadas como não produtoras de biofilmes (OD595 < 0,1), mesmo após várias passagens durante o estudo evolutivo. Pelo contrário, estirpes com profagos inseridos no genoma, Hp_5771G e Hp_10222C, após 148 e 192 gerações in vitro, respetivamente, mudaram a sua capacidade de formação de biofilme: a estirpe Hp_5771G passou da classificação de não produtora para a classificação de forte produtora de biofilme (teste t de Student foi usado para avaliar a diferença entre as ODs obtidas, demonstrando ser significativa, p = 0,0034) e a estirpe Hp_10222C passou de uma classificação de não produtora para fraca produtora de biofilme (diferença estaticamente não significativa, p = 0,054). Embora a estirpe Hp_5771G sofresse o maior número de mutações durante o estudo evolutivo, nenhuma mutação associada a genes que codificam proteínas com função de estabelecer o biofilme foi encontrada. É importante referir que foram encontradas 41 mutações em genes que codificam proteínas hipotéticas, sendo possível que alguma destas proteínas hipotéticas possa ter uma função essencial para a formação de biofilmes. Outra hipótese levantada consiste em que os padrões de expressão das proteínas podem ter sido alterados durante o estudo evolutivo, pelo que uma análise adicional do transcritoma e do metiloma pode explicar a diferença de capacidade de produção de biofilmes. De forma a analisar a composição da matriz do biofilme da estirpe Hp_1022C, após 5 dias, o biofilme foi incubado com diferentes concentrações de Proteinase K e DNase I. O biofilme da estirpe Hp_10201A apresentou valores de OD595 aquando a incubação com Proteinase K, entre 24% e 36% menores do que em relação ao controlo, onde o biofilme foi apenas incubado com meio de cultura, o que levanta a hipótese de um papel mais importante das proteínas do que do DNA extracelular na formação do biofilme. Embora, várias estruturas proteicas possam ser encontradas no biofilme de H. pylori, como as proteínas de membrana externa, VacA e CagA, flagelos, entre outras encontradas em vesículas da membrana externa bacteriana e os pili. Ademais, relatamos a implementação e otimização de um protocolo para o estudo da virulência de H. pylori em larvas de Galleria mellonella, que atualmente estão a ser usadas para comparar estirpes ancestrais e evoluídas. De forma a avaliar o desenvolvimento e progresso da infeção de H. pylori em larvas de Galleria mellonella, procedeu-se a implementação de um protocolo de infeção com o objetivo de identificar a dose letal media (DL50). Dois grupos foram criados, um controlo e um grupo de infeção. O grupo de infeção foi injetado com duas concentrações diferentes, um de 105 e outro de 108 UFC/ml da estirpe Hp_J99. Uma análise da sobrevivência das larvas após 120 horas, não revelou diferenças significativas entre os dois grupos. Num outro ensaio realizado, o grupo de infeção foi injetado com outra estirpe, a Hp_10222A contendo um profago inserido no seu genoma, a uma concentração de 107 UFC/ml e, em apenas 48h, revelou uma sobrevivência cumulativa inferior. É possível que as passagens acumuladas da estirpe Hp_J99 possam contribuir para uma virulência inferior quando comparada com uma estirpe recentemente isolada, como a Hp_10222A. Por fim, a atividade direta de uma endolisina, LysI, foi testada em biofilmes da estirpe Hp_10201A. O biofilme não sofreu nenhuma diminuição após a incubação com LysI. Uma possível explicação para isto poderá estar na inacessibilidade do peptidoglicano à endolisina. É preciso encontrar um sistema de entrega capaz de destabilizar a membrana exterior da bactéria, como é o caso dos lipossomas.Helicobacter pylori is a human pathogen, estimated to colonize 50% of the population worldwide, mainly during the childhood. H. pylori has many virulence factors, such as VacA and CagA for which contribute to its high specificity and high pathogenicity to the human stomach. Importantly, the bacterium has a large allelic and high genetic diversity result of recombination, mutation events, genome reassortment and horizontal gene transfer (HGT) events (naturally competent). Even though several studies aim to study the microevolution of H. pylori, no experimental study has been done. Importantly, several prophages have been identified in genome of H. pylori strains. These prophages seem to share a co-evolutionary process with H. pylori. Nevertheless, the consistent presence of prophages in H. pylori genomes over time as well as the impact of prophage on H. pylori evolution remains largely unknown. In this study we report the genomic analysis of the evolution of three H. pylori strains, with and without prophages, over several generations in vitro. We were able to identified several distinct single and multiple nucleotides polymorphisms targeting namely membrane proteins, host interaction proteins and DNA transduction and replication proteins. We report a mutation rate per year per site between 3.35E-07 and 5.24E-06 for the analyzed strains. After the evolutionary assay was complete, the ancestral and evolved strains were compared using a biofilm formation assay. Interesting, no mutation has found in prophage genes, pointing to their genome stability. These two strains harboring prophages changed classification in ability to form biofilm, becoming biofilm producers, to strong and weak, respectably. Also, we report the implementation and optimization of a protocol for the study of the virulence of H. pylori in Galleria mellonella larvae, which are currently being used to compare both ancestral and evolved strains after the evolutionary assay.Vale, Ana Filipa Ferreira doHanscheid, ThomasRepositório da Universidade de LisboaOliveira, Ricardo João Lopes de2023-03-272025-03-27T00:00:00Z2023-03-27T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/59476TID:203266374enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:08:34Zoai:repositorio.ul.pt:10451/59476Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:09:22.210698Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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