Construção de linhagens recombinantes de Xanthomonas sp. para a produção de Goma Xantana
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Dissertação |
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Texto Completo: | https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/14400 |
Resumo: | Xanthan gum is a polysaccharide produced by bacteria from the genus Xanthomonas. This biopolymer has many industrial applications such as in food and cosmetics production, oil extraction process, among others. There is no national production of this compound, which leads us to import high volumes of xanthan gum annually. Currently, the development of production processes for this biopolymer has focused on the optimization of growth media and operational parameters, as well as on downstream steps to recover the product from the fermentation broth. However, a key aspect of this process is the development of optimized strains. In this context, a deterministic model in Python developed by Kundlascht (2017) identified the reactions catalyzed by UDP-Glucose pyrophosphorylase (UDPG-PP) and UDP-Glucose dehydrogenase (UDPG-deH) as being the bottleneck of the xanthan gum biosynthesis pathway. The model predicted the system behavior with the enzymes’ super-expression, indicating a significant rise in the gum monomers synthesis. From these results, the present work sought the hypothesis validation performing the cloning and the transformation of the genes galU (UDPG-PP) e Udg (UDPG-deH) in Xanthomonas campestris pv. campestris (XCC) using a broad host range plasmid as the backbone. Three plasmids were then produced containing each individual gene or both genes together, which were respectively named pLACR1_deH, pLACR1_PP and pLACR1_OP. To evaluate gum production by the new transformed strains with the constructed plasmids, cultures were performed in shake flasks with two different inducer concentrations. The results showed up to 21.7% more productivity (Pr) of xanthan gum for the best recombinant strain compared to the parental strain. This result validates the initial hypothesis about the pathway bottlenecks identified by in silico analysis. |
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Currently, the development of production processes for this biopolymer has focused on the optimization of growth media and operational parameters, as well as on downstream steps to recover the product from the fermentation broth. However, a key aspect of this process is the development of optimized strains. In this context, a deterministic model in Python developed by Kundlascht (2017) identified the reactions catalyzed by UDP-Glucose pyrophosphorylase (UDPG-PP) and UDP-Glucose dehydrogenase (UDPG-deH) as being the bottleneck of the xanthan gum biosynthesis pathway. The model predicted the system behavior with the enzymes’ super-expression, indicating a significant rise in the gum monomers synthesis. From these results, the present work sought the hypothesis validation performing the cloning and the transformation of the genes galU (UDPG-PP) e Udg (UDPG-deH) in Xanthomonas campestris pv. campestris (XCC) using a broad host range plasmid as the backbone. Three plasmids were then produced containing each individual gene or both genes together, which were respectively named pLACR1_deH, pLACR1_PP and pLACR1_OP. To evaluate gum production by the new transformed strains with the constructed plasmids, cultures were performed in shake flasks with two different inducer concentrations. The results showed up to 21.7% more productivity (Pr) of xanthan gum for the best recombinant strain compared to the parental strain. This result validates the initial hypothesis about the pathway bottlenecks identified by in silico analysis.Goma xantana é um polissacarídeo sintetizado por bactérias do gênero Xanthomonas que apresenta diversas aplicações industriais, como na produção de alimentos, cosméticos e extração de petróleo, entre outras. Não há produção nacional do composto e, por isso, o Brasil segue dependendo de importações de grandes quantidades do biopolímero. Atualmente o desenvolvimento de processos de produção da goma tem sido direcionado para a otimização de fatores como meios de cultivo, condições operacionais e tecnologias para recuperação do composto de interesse. No entanto, parte chave desse processo é o desenvolvimento de linhagens otimizadas. Nesse contexto, Kundlascht (2017) através de um modelo matemático determinístico para a síntese dos monômeros da goma xantana, identificou as reações catalisadas por UDP-Glicose pirofosforilase (UDPG-PP) e UDP-Glicose desidrogenase (UDPG-deH) como sendo possíveis gargalos da via de síntese da goma xantana, e previu o comportamento do sistema diante da super-expressão destas duas enzimas, apontando um aumento substancial na síntese dos monômeros da goma. A partir desses resultados, o presente trabalho buscou a validação da hipótese, e realizou a clonagem e transformação dos genes galU (UDPG-PP) e Udg (UDPG-deH) em Xanthomonas campestris pv. campestris (XCC) utilizando como base um vetor de amplo espectro de hospedeiros. Foram construídos então três plasmídeos, contendo cada gene individual e ambos genes em conjunto, denominados respectivamente pLACR1_deH, pLACR1_PP e pLACR1_OP. Para avaliação da produção de goma pelas linhagens transformadas com os novos plasmídeos, foram realizados cultivos em frascos agitados e com a avaliação de duas concentrações distintas de indutor. Os resultados obtidos mostraram até 21,7% a mais de produtividade (Pr) de goma xantana para a melhor linhagem recombinante quando comparada à linhagem parental, validando a hipótese inicial sobre os gargalos da via identificados pelas análises in silico.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)130092/2020-7porUniversidade Federal de São CarlosCâmpus São CarlosPrograma de Pós-Graduação em Engenharia Química - PPGEQUFSCarAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessGoma xantanaXanthan gumXanthomonasVetores de expressãoEngenharia metabólicaExpression vectorsMetabolic engineeringCIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULARConstrução de linhagens recombinantes de Xanthomonas sp. para a produção de Goma XantanaConstruction of recombinant strains of Xanthomonas sp. for Xanthan Gum productioninfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis6006001c7296d8-a6a1-4938-92ff-1182b3437864reponame:Repositório Institucional da UFSCARinstname:Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR)instacron:UFSCARORIGINALDissertação Definitiva de Mestrado DAVI BENEDITO OLIVEIRA.pdfDissertação Definitiva de Mestrado DAVI BENEDITO OLIVEIRA.pdfDissertação de Mestradoapplication/pdf4384966https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14400/4/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20Definitiva%20de%20Mestrado%20DAVI%20BENEDITO%20OLIVEIRA.pdf06f08bdaaa960960ee01023372135c67MD54Carta Comprovante _ versao final dissertacao.pdfCarta Comprovante _ versao final dissertacao.pdfCarta comprovante assinada pelo orientadorapplication/pdf67350https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14400/2/Carta%20Comprovante%20_%20versao%20final%20dissertacao.pdf3442f87a4f1c0b680a49afeda4e5cfa1MD52CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14400/5/license_rdfe39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34MD55TEXTDissertação Definitiva de Mestrado DAVI BENEDITO OLIVEIRA.pdf.txtDissertação Definitiva de Mestrado DAVI BENEDITO OLIVEIRA.pdf.txtExtracted texttext/plain217968https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14400/6/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20Definitiva%20de%20Mestrado%20DAVI%20BENEDITO%20OLIVEIRA.pdf.txtfe15763d0e70895fa92ac390b426b426MD56Carta Comprovante _ versao final dissertacao.pdf.txtCarta Comprovante _ versao final dissertacao.pdf.txtExtracted texttext/plain1223https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14400/8/Carta%20Comprovante%20_%20versao%20final%20dissertacao.pdf.txt40a8c19d2b4524ef4fb1e20c52a862e3MD58THUMBNAILDissertação Definitiva de Mestrado DAVI BENEDITO OLIVEIRA.pdf.jpgDissertação Definitiva de Mestrado DAVI BENEDITO OLIVEIRA.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg5162https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14400/7/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20Definitiva%20de%20Mestrado%20DAVI%20BENEDITO%20OLIVEIRA.pdf.jpg44327e1771e66adcd72e2994062cb9e0MD57Carta Comprovante _ versao final dissertacao.pdf.jpgCarta Comprovante _ versao final dissertacao.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg11839https://repositorio.ufscar.br/bitstream/ufscar/14400/9/Carta%20Comprovante%20_%20versao%20final%20dissertacao.pdf.jpg6babf9ad5a19e71423b1dcd614927bb2MD59ufscar/144002023-09-18 18:32:11.877oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/14400Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufscar.br/oai/requestopendoar:43222023-09-18T18:32:11Repositório Institucional da UFSCAR - Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR)false |
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