Análise quantitativa de ocratina A (OTA) em plasma humano por ensaio imunoenzimático, e efeito citotóxico in vitro de OTA e FB1 em linhagem celular Jurkat e P3U1

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rigobello, Fabiana Felipin
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UEL
Texto Completo: https://repositorio.uel.br/handle/123456789/15113
Resumo: Resumo: Micotoxinas são metabólitos secundários de fungos pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium e são contaminantes naturais de alimentos no Brasil Ocratoxina A (OTA) e Fumonisina B1 (FB1) são classificados como possível carcinógenos para humanos e animais (grupo 2B) Esta pesquisa objetivou introduzir metodologia de ELISA para analisar e quantificar a presença de OTA em plasma humano e avaliar o efeito de OTA e FB1 in vitro em linhagem celular P3U1 e Jurkat Na primeira etapa do trabalho: (1) investigou-se a presença de OTA no plasma de pacientes por ELISA competitivo indireto usando anticorpos monoclonais (AcM) anti-OTA; (2) determinou-se a estimativa de ingesta diária de OTA por estes pacientes e; (3) avaliou-se a correlação da presença de OTA com marcadores plasmáticos de lesão hepática e renal Os resultados obtidos demonstraram que OTA foi detectada em 55% das amostras (733,6 ± 296,4 pg/mL, máximo 1584,6 pg/mL), com uma estimativa de ingesta diária de 983,1-1445,3 pg/kg de peso corporal Não houve correlação entre os níveis de OTA e parâmetros bioquímicos (AST, ALT, ureia e creatinina) Na segunda etapa, avaliou-se: (1) o efeito citotóxico de OTA e FB1, individualmente ou em associações, sobre linhagens celulares P3U1 e Jurkat, através do método de brometo de [3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (MTT) e dosagem de lactato desidrogenase (LDH) e; (2) a interação de AcM anti-OTA em células tratadas com OTA por imunocitoquímica A viabilidade das células foi reduzida com exposição à 9 µg/mL de micotoxinas após 24 h, sendo que OTA reduziu a viabilidade de P3U1 e Jurkat de forma semelhante, e FB1 somente de célula Jurkat O uso associado de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxico sobre as células Os métodos de MTT e LDH apresentaram forte correlação nas células Jurkat (r = ,749) e P3U1 (r = ,931) Imunocitoquímica confirmou a diminuição da viabilidade celular de Jurkat e P3U1 tratadas com OTA, bem como aumento de grânulos intracelulares marcados com substrato peroxidase e destruição da membrana plasmática com liberação do citosol, indicando a presença de OTA nestas células Conclui-se que pessoas no Brasil estão contaminadas por OTA, porém o nível de contaminação está abaixo do limite tolerável divulgado por órgãos internacionais, e possivelmente esse é o motivo pelo qual não se observou correlação entre os níveis plasmáticos de OTA e parâmetros bioquímicos de lesão hepática e renal Conclui-se com os resultados in vitro que a presença de OTA induz citotoxicidade, mas nas condições estudadas, a associação de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxico
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(3) avaliou-se a correlação da presença de OTA com marcadores plasmáticos de lesão hepática e renal Os resultados obtidos demonstraram que OTA foi detectada em 55% das amostras (733,6 ± 296,4 pg/mL, máximo 1584,6 pg/mL), com uma estimativa de ingesta diária de 983,1-1445,3 pg/kg de peso corporal Não houve correlação entre os níveis de OTA e parâmetros bioquímicos (AST, ALT, ureia e creatinina) Na segunda etapa, avaliou-se: (1) o efeito citotóxico de OTA e FB1, individualmente ou em associações, sobre linhagens celulares P3U1 e Jurkat, através do método de brometo de [3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (MTT) e dosagem de lactato desidrogenase (LDH) e; (2) a interação de AcM anti-OTA em células tratadas com OTA por imunocitoquímica A viabilidade das células foi reduzida com exposição à 9 µg/mL de micotoxinas após 24 h, sendo que OTA reduziu a viabilidade de P3U1 e Jurkat de forma semelhante, e FB1 somente de célula Jurkat O uso associado de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxico sobre as células Os métodos de MTT e LDH apresentaram forte correlação nas células Jurkat (r = ,749) e P3U1 (r = ,931) Imunocitoquímica confirmou a diminuição da viabilidade celular de Jurkat e P3U1 tratadas com OTA, bem como aumento de grânulos intracelulares marcados com substrato peroxidase e destruição da membrana plasmática com liberação do citosol, indicando a presença de OTA nestas células Conclui-se que pessoas no Brasil estão contaminadas por OTA, porém o nível de contaminação está abaixo do limite tolerável divulgado por órgãos internacionais, e possivelmente esse é o motivo pelo qual não se observou correlação entre os níveis plasmáticos de OTA e parâmetros bioquímicos de lesão hepática e renal Conclui-se com os resultados in vitro que a presença de OTA induz citotoxicidade, mas nas condições estudadas, a associação de OTA e FB1 não aumentou o efeito citotóxicoTese (Doutorado em Patologia Experimental) - Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia ExperimentalAbstract: Mycotoxins are secondary metabolites of some fungi from the genra Aspergillus, Penicillium and Fusarium and are natural contaminants of several foods in Brazil Ochratoxin A (OTA) and Fumonisin B1 (FB1) are classified as possible carcinogens to humans and animals (group 2B) Current research aimed to introduce the use of ELISA to analyze and quantify the presence of OTA in human plasma and to evaluate the effect of OTA and FB1 in vitro on P3U1 and Jurkat cell lines In the first phase of the research: (1) indirect competitive ELISA with monoclonal antibodies (mAb) anti-OTA was employed to detect the presence of OTA in human plasma; (2) the average daily intake of OTA was estimated and; (3) correlation was calculated between OTA and biomarkers for liver and kidney damage Results showed that OTA was present in 55% of the samples (7336 ± 2964 pg/mL, maximum of 15846 pg/mL), with an estimated daily intake of 9831-14453 pg/kg body weight There was no correlation between the levels of OTA and biochemical parameters (AST, ALT, urea and creatinine) In the second phase of the research, it was evaluated: (1) the effect of OTA and FB1, individually or associated, on P3U1 and Jurkat cell lines by the 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase dosage (LDH) assays and; (2) the interaction of mAb anti-OTA to OTA treated cells by immunocytochemistry Cell viability was reduced after 24 h exposure to 9 µg/mL of the mycotoxins, with OTA reducing viability of P3U1 and Jurkat cells in similar ways, and FB1 only of Jurkat cells The associated use of OTA and FB1 did not increase the cytotoxic effect on the cells MTT and LDH had a strong correlation for Jurkat (r = ,749) and P3U1 cells (r = ,931) Immunocytochemistry confirmed the decrease of viability of P3U1 and Jurkat cells treated with OTA, with an increase of intracellular granules marked with peroxidase substrate and destruction of the plasma membrane with the release of cytosol, indicating the presence of OTA in these cells It can be concluded that people in Brazil are contaminated with OTA, however, the level of contamination is below the limits established by international agencies, and possibly this is the reason why there was no correlation between OTA and the markers for liver and kidney damage Also, the in vitro results demonstrate that OTA induces cytotoxicity, but under the studied conditions, the association of OTA and FB1 did not increase the toxic effect of the mycotoxinsItano, Eiko Nakagawa [Orientador]Marquez, Audrey de SouzaOno, Elisabete Yurie SataqueVenâncio, Emerson JoséKwasniewski, Fábio HenriqueHirooka, Elisa Yoko [Coorientadora]Rigobello, Fabiana Felipin2024-05-01T14:45:03Z2024-05-01T14:45:03Z2015.0029.06.2015info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://repositorio.uel.br/handle/123456789/15113porDoutoradoPatologia ExperimentalCentro de Ciências BiológicasPrograma de Pós-Graduação em Patologia ExperimentalLondrinareponame:Repositório Institucional da UELinstname:Universidade Estadual de Londrina (UEL)instacron:UELinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-07-12T04:19:55Zoai:repositorio.uel.br:123456789/15113Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.bibliotecadigital.uel.br/PUBhttp://www.bibliotecadigital.uel.br/OAI/oai2.phpbcuel@uel.br||opendoar:2024-07-12T04:19:55Repositório Institucional da UEL - Universidade Estadual de Londrina (UEL)false
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