Estudo da atividade antitumoral e avaliação do potencial anti-metastático do hipoglicemiante metformina sobre células leucêmicas humanas resistentes a múltiplas drogas (MDR)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Renó, Débora Liliane de Souza
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFABC
Texto Completo: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=118160
Resumo: Orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina Santos de Souza Galvão
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spelling Estudo da atividade antitumoral e avaliação do potencial anti-metastático do hipoglicemiante metformina sobre células leucêmicas humanas resistentes a múltiplas drogas (MDR)LUCENA-1CLORIDRATO DE METFORMINASINALIZAÇÃO DE MORTEMETFORMIN HYDROCHLORIDEDEATH SIGNALINGPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOSSISTEMAS - UFABCOrientadora: Profa. Dra. Ana Carolina Santos de Souza GalvãoTese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2019.O processo de tumorigênese associa uma alta taxa proliferativa celular a um falho sistema inibidor de proliferação ou indutor de morte. Estas alterações na fisiologia celular normal decorrem diretamente da ativação de oncogenes juntamente a inativação de genes supressores tumorais. A transformação celular maligna ocorre de forma orquestrada pela a aquisição, ao longo do tempo, de habilidades capazes de sustentar o desenvolvimento de células tumorais. A aquisição da anormalidade cromossômica BCR-ABL em células mieloides hematopoiéticas impulsiona o desenvolvimento da Leucemia Mieloide Crônica (LMC) neoplasia que, anualmente, mata cerca de 7.000 brasileiros. A proteína tirosina quinase constitutivamente ativa Bcr-Abl, transcrito a partir do cromossomo Philadelphia, constitui o alvo padrão de medicamentos inibidores os quais frequentemente perdem a eficácia diante a obtenção mecanismos de resistência tumoral. Desta forma, a busca por agentes antitumorais capazes de inibir os efeitos de Bcr-Abl e a emergência de resistência tumoral impulsionam estudos não apenas no tratamento de leucemias, mas também de outros tipos tumorais. Neste contexto, evidencia-se os efeitos da metformina euglicemiante prescrito desde 1979 no tratamento da diabetes mellitus tipo 2 em inibir tumorigênese e induzir morte em células tumorais de diferentes origens em análises in vitro e in vivo. Neste trabalho avaliamos os efeitos da metformina em células Lucena-1, linhagem de LMC caracterizada pela presença de fenótipo de resistência à múltiplas drogas. Após tratamento com metformina por tempos variados foi utilizado teste de redução de MTT para viabilidade celular, citometria de fluxo para análise de progressão do ciclo celular e apoptose, microscopia e ensaios em placas transwell para adesão, migração e invasão celular, zimografia para atividade de metaloproteinases e, finalmente, Western Blotting para análise de expressão de proteínas. Os resultados obtidos ilustram os efeitos concentração e tempo dependentes redutores de viabilidade celular em Lucena-1 tratada com metformina. Em tratado exposto ao euglicemiante por 48 horas, concentrações próximas a 30 mM de metformina diminuem em 50% a viabilidade de Lucena-1 segundo redução de MTT. Tratamentos com 60 mM de metformina reduzem para 5% a viabilidade das células leucêmicas resistentes a múltiplas drogas, mesma condição não significativamente tóxica para células mononucleadas de sangue periférico (PBMC) ou fibroblastos murinos (Balb/c 3T3). O efeito antiproliferativo de metformina envolve inibição de progressão do ciclo celular nas fases G0/G1 e S. Metformina induz morte celular apoptótica em Lucena-1 ativando AMPK. Análises por Western Blotting e citometria de fluxo mostram o aumento da forma clivada e ativa da Caspase-3 em tratamentos com 20 e 40 mM de metformina, corroborando com a clivagem de PARP que tem o nível da sua forma clivada inativa aumentado nas mesmas concentrações do euglicemiante mencionadas. Metformina promove a ativação da via apoptótica intrínseca e extrínseca efeito observado a partir da ativação das caspases 9 e 8, respectivamente. Adicionalmente observa-se indução de processo autofágico nas células tratadas com metformina. O potencial anti-metastático de metformina em Lucena-1 é evidenciado pela sua capacidade de reduzir a adesão e invasão celular e, também, a atividade de MMP-9 e MMP-2. Lucena-1 expostas a concentrações sub-tóxicas do euglicêmico têm seu metabolismo oxidativo mitocondrial parcialmente inibido, aumentando a produção e liberação de lactato e sua dependência por captação de glicose de forma a aumentar os efeitos antiproliferativos da metformina quando há redução da disponibilidade de glicose no meio ou sua associação com 2-DG. Logo, os efeitos de metformina em Lucena-1 são prioritariamente citostáticos e demonstram seu potencial como fármaco antileucêmico.The tumorigenesis process associates a high proliferative cell rate to a defective proliferation inhibitory or death inducing system. These changes in normal cell physiology stem directly from the activation of oncogenes together with the inactivation of tumor suppressor genes. Malignant cell transformation occurs in an orchestrated fashion by the acquisition, over time, of abilities capable of sustaining the development of tumor cells. The acquisition of BCR-ABL chromosomal abnormality in hematopoietic myeloid cells boosts the development of Chronic Myelogenous Leukemia (CML) neoplasia, which annually kills about 7,000 Brazilians. The constitutively active Bcr-Abl protein tyrosine kinase, transcribed from the Philadelphia chromosome, is the standard target of inhibitory drugs which often lose effectiveness in achieving mechanisms of tumor resistance. Thus, the search for antitumor agents capable of inhibiting the effects of Bcr-Abl and the emergence of tumor resistance boosts studies not only in the treatment of leukemias, but also of other tumor types. In this context, the effects of euglycemic metformin prescribed since 1979 in the treatment of type 2 diabetes mellitus in inhibiting tumorigenesis and inducing death in tumor cells of different origins are analyzed in vitro and in vivo. In this work, we evaluated the effects of metformin on Lucena-1 cells, a CML strain characterized by the presence of multiple drug resistance phenotype. After treatment with metformin for various times, MTT reduction test for cell viability, flow cytometry for analysis of cell cycle progression and apoptosis, microscopy and transwell plate assays for adhesion, migration and cell invasion, zymography for metalloproteinase activity and finally, Western Blotting for protein expression analysis. The results obtained illustrate the concentration and time-dependent effects of cell viability in Lucena-1 treated with metformin. In a treatment exposed to the euglycemic for 48 hours, concentrations near 30 mM metformin decrease by 50% the viability of Lucena-1 according to MTT reduction. Treatments with 60 mM metformin reduce the viability of multiple drug resistant leukemic cells to 5%, the same condition not significantly toxic to peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or murine fibroblasts (Balb/c 3T3). The antiproliferative effect of metformin involves inhibition of cell cycle progression in G0/G1 and S phases. Metformin induces apoptotic cell death in Lucena-1 activating AMPK. Western Blotting analysis and flow cytometry show the increase of the cleaved and active form of Caspase-3 in treatments with 20 and 40 mM metformin, corroborating the cleavage of PARP having the level of its inactive cleaved form increased at the same concentrations of mentioned. Metformin promotes the activation of the intrinsic and extrinsic apoptotic pathway observed from the activation of caspases 9 and 8, respectively. Additionally, autophagic process induction is observed in cells treated with metformin. The anti-metastatic potential of metformin in Lucena-1 is evidenced by its ability to reduce cell adhesion and invasion, as well as the activity of MMP-9 and MMP-2. Lucena-1 exposed to sub-toxic euglycemic concentrations have partially inhibited their mitochondrial oxidative metabolism, increasing lactate production and release, and their dependence on glucose uptake in order to increase the antiproliferative effects of metformin when glucose availability is reduced medium or its association with 2-DG. Thus, the effects of metformin on Lucena-1 are primarily cytostatic and demonstrate its potential as an antileukemic drug.Galvão, Ana Carolina Santos de SouzaFerreira-Halder, Carmen VeríssimaSouza, Roberta Regina Ruela deRamos, Marcela Sorelli CarneiroLombello, Christiane BertachiniRenó, Débora Liliane de Souza2019info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf103 f. : il.http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=118160http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=118160&midiaext=77420http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=118160&midiaext=77419Cover: http://biblioteca.ufabc.edu.br/php/capa.php?obra=118160porreponame:Repositório Institucional da UFABCinstname:Universidade Federal do ABC (UFABC)instacron:UFABCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2022-03-18T16:00:49Zoai:BDTD:118160Repositório InstitucionalPUBhttp://www.biblioteca.ufabc.edu.br/oai/oai.phpopendoar:2022-03-18T16:00:49Repositório Institucional da UFABC - Universidade Federal do ABC (UFABC)false
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