Suportes magnéticos na imobilização da enzima nucleosídeo hidrolase de Leishmania donovani para o desenvolvimento de ensaios de triagem

• Autor(a) principal: Oliveira, Pamella Christina Ortega de
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da Universidade Federal Fluminense (RIUFF)
• Texto Completo: http://app.uff.br/riuff/handle/1/30958
• topic: Nucleosideo hidrolase; Leishmaniose visceral; Partículas magnéticas; Ensaios de triagem; Imobilização enzimática; Protozoário; Nucleosideo; Leishmaniose; Nanopartícula; Cromatografia; Inibidor enzimático; Cinética enzimática; Nucleoside hydrolase; Visceral leishmaniasis; Magnetic particles; Screening assays; Enzyme immobilization

A enzima nucleosídeo hidrolase (NH) possui papel fundamental na sobrevivência dos protozoários do gênero Leishmania. A sua presença em mamíferos ainda não foi reportada, o que a torna um alvo interessante para o desenvolvimento de protótipos de novos fármacos mais seletivos. A leishmaniose visceral (LV) é considerada uma das formas clínicas mais severas desse grupo de doenças e é causada por protozoários da espécie Leishmania donovani. Portanto, o desenvolvimento de novos ensaios de triagem, com elevada eficiência e produtividade, para a identificação de inibidores da NH pode acelerar as primeiras etapas do processo de descoberta de fármacos para o tratamento da LV. Neste trabalho, a enzima NH de Leishmania donovani (LdNH) foi imobilizada covalentemente em partícula magnética (PM) comercial de 1 μm e em nanopartículas magnéticas (NPMs), de diferentes tamanhos de diâmetro (25, 57, 105 nm) e recobrimentos (recobrimento com camada de sílica e ligante orgânico - ácido 6-aminoexil fosfônico), sintetizadas a partir da termo decomposição do acetilacetonato de ferro (III). Inicialmente, utilizou-se PM para o desenvolvimento e qualificação do ensaio de triagem em fluxo. Utilizando um arranjo de 8 imãs, PM recobertas com enzima foram retidas em um tubo de politetrafluoretileno resultando em um reator com enzima imobilizada (LdNH-PM-IMER), que foi acoplado ao sistema de cromatografia líquida através de uma conexão “T” para o monitoramento da atividade enzimática através da quantificação do produto hipoxantina por CLAE-DAD. Estudos cinéticos forneceram um valor de KMapp de 2079 ± 87 μmol L-1 para o substrato inosina utilizando LdNH-PM-IMER. A qualificação do LdNH-PM-IMER para fins de triagem em fluxo foi realizada com uma série de 14 ribonucleosídeos sintéticos. Destes, quatro foram identificados como novos inibidores competitivos de LdNH, com valores de Ki entre 29,7 e 169,4 μmol L-1. As NPMs foram empregadas na imobilização da LdNH e utilizadas em dois métodos de ensaio de atividade distintos. Utilizando o ensaio de atividade estático, as LdNH-NPMs foram caracterizadas através de estudo cinético e pela avaliação de sua estabilidade e reusabilidade. Após estudo no modo estático, as LdNH-NPMs foram utilizadas no método em fluxo, que através de estudo cinético, foi possível otimizar as condições experimentais do ensaio. O estudo cinético dos LdNH-NPM-IMERs apresentou valores de KMapp na faixa de 1929 – 3962 μmol L-1, utilizando um terço da massa de suporte usada na fabricação de LdNH-PM-IMER. O novo ensaio de triagem em fluxo desenvolvido provou ser confiável e uma valiosa ferramenta para a identificação de novas substâncias bioativas. O uso das NPMs no desenvolvimento desses métodos permitiu uma miniaturização do sistema, otimizando o uso de alvo biológico sem perder a eficiência.