Identificação de um domínio conservado e antigênico de ATP difosfohidrolases de parasitos, também presente em uma isoforma ativa de Leishmania (Leishmania) chagasi

• Autor(a) principal: Maia, Ana Carolina Ribeiro Gomes
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFJF
• Texto Completo: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/10942
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA; L. infantum; Apirase de batata; Filogenia; Conservação; Domínio; Peptídeo; Anticorpo; Humano; Cão; Camundongo; Leishmaniose visceral canina; L. infantum; Potato apyrase; Phylogeny; Conservation; Domain; Peptides; Antibody; Human; Dog; Mouse; Canine visceral leishmaniasis

Através do alinhamento de sequências de aminoácidos, análise filogenética e predição de peptídeos, nós demonstramos uma relação evolucionária e estreita relação estrutural entre um domínio particular da apirase de batata e várias proteínas de organismos patogênicos, todos eles pertencentes à família das ATP difosfohidrolases. Um fragmento recombinante baseado neste domínio (rDomB) foi obtido como uma proteína fusionada a hexahistidina. Por ELISA, significativa soropositividade de IgG para o rDomB foi observada em amostras de soros de pacientes (n=30) com esquistossomose (37%) ou leishmaniose tegumentar (40%), mas não para pacientes com doença de Chagas (20%). Adicionalmente, o inóculo de camundongos Balb/c (n=9) com rDomB induziu significativa atividade estimulatória, elevando a quantidade de anticorpos IgG, e as subclasses IgG1 e IgG2a, como observado por ELISA, sugerindo que o rDomB tem epitopos distintos capazes de induzir respostas imune dos tipos Th1 e Th2. Portanto, um domínio específico é sugerido ser potencialmente envolvido na resposta imune, e também parece ter sido conservado durante a co-evolução de hospedeiros e parasitos. Uma proteína predita identificada como NDPase, homóloga à apirase de batata, foi encontrada no genoma de Leishmania infantum (sin. L. (L.) chagasi), o agente causador da leishmaniose visceral canina. Uma atividade ATP difosfohidrolásica foi então caracterizada em preparações de promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (MHOM/BR/1972/BH46 strain). A hidrólise de nucleosídeos di- ou trifosfatados sob a ativação de íons bivalentes, não afetada significativamente por outras fosfohidrolases, associadas à inibição promovida pela azida sódica, sugeriram fortemente uma atividade ATP difosfohidrolásica. “Western blots” desenvolvidos com anticorpos policlonais de coelho anti-apirase de batata ou anticorpos policlonais de camundongo anti-rDomB reconheceram a mesma banda de aproximadamente 50 kDa. Anticorpos anti-apirase de batata ou anti-rDomB imobilizados em Proteína A-Sepharose depletaram em torno de 86% e 41%, respectivamente, de ambas as atividades ATPásica e ADPásica de uma preparação de promastigotas solubilizada em C12E9. Os complexos resina-anticorpo de coelho-antígeno e resina-anticorpo de camundongo-antígeno foram separados por SDS-PAGE, e “Western blots” desenvolvidos, respectivamente, com anticorpos policlonais de camundongo anti-rDomB ou anticorpos policlonais de coelho anti-apirase de batata identificaram a mesma banda de 50 kDa. Por “Western blots” e ELISA, usando apirase de batata como antígeno, reatividade significativa de anticorpos IgG foi observada em soros de cães com leishmaniose visceral (INF; n= 38), domiciliados em área endêmica, sugerindo que aqueles epitopos compartilhados são antigênicos. A soropositividade de IgG do grupo INF (38%) para o rDomB foi elevada, e significativamente (P<0,001) maior que aquela encontrada em cães saudáveis também domiciliados em área endêmica (n=18; 12%). A soropositividade de anticorpos IgG para o rDomB foi significativamente maior em grupo de cães clinicamente classificados como sintomático (n=15; 67%) quando comparado aos grupo de assintomáticos (n=11; 18%) ou oligosintomáticos (n=12, 18%). Análise individual revelou variável reatividade de anticorpos IgG1 e IgG2 para rDomB, sugerindo que diferentes epitopos poderiam estar envolvidos na susceptibilidade ou resistência a leishmaniose visceral canina. Concluindo, nossos resultados confirmaram que uma isoforma de ATP difosfohidrolase ativa é expressa em promastigotas de L. (L.) chagasi, e que ela tem um domínio conservado e antigênico compartilhado com a apirase de batata. Além disso, nós indicamos o rDomB como uma nova biomolécula a ser testada em protocolos de estudos da leishmaniose visceral canina.