Identificação e caracterização de proteínas de ligação a RNA diferencialmente expressas em Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: Bruna Mattioly Valente
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/35473
• topic: Bioquímica; Imunologia; Proteínas de ligação a RNA; Trypanosoma cruzi; Doença de Chagas

O Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas, tem três estágios de desenvolvimento que são bioquimicamente e morfologicamente distintos e que respondem rapidamente às mudanças ambientais que o parasita enfrenta durante seu ciclo de vida. Ao contrário de outros eucariotos, o genoma do T. cruzi contêm genes codificadores de proteínas que são transcritos em pré-mRNAs policistrônicos antes de serem processados em mRNAs maduros por meio de reações de trans-splicing e de poliadenilação. Sendo assim, o controle da expressão gênica depende, principalmente, de mecanismos pós-transcricionais que podem ser mediados por proteínas de ligação a RNA (RBP), que atuam controlando a estabilidade dos níveis de mRNA e/ou a taxa de tradução desses RNAs. Pesquisando por motivos presentes em RBPs de eucariotos, identificamos no genoma do clone CL Brener do T. cruzi, 253 sequencias codificantes para proteínas contendo motivos de reconhecimento a RNA (RRM), PABP, Alba, Pumilio e o motivo zinc finger. Usando dados de RNA-Seq gerados a partir de mRNAs presentes em epimastigotas, tripomastigotas liberadas em cultura e amastigotas coletadas em dois tempos de infecção de fibroblastos humanos, analisamos a expressão das RBPs de T. cruzi ao longo do ciclo de vida desse parasita. Entre os cinco genes com expressão aumentada em epimastigotas de CL Brener, comparada com amastigotas e tripomastigotas, identificamos o gene TcCLB.506739.99 que codifica uma RBP contendo motivo zinc finger. A importância dessa RBP foi revelada em estudos com epimastigotas nocautes que mostraram redução de crescimento no final da fase logarítimica e um aumento na capacidade de diferenciação em tripomastigotas metacíclicas comparado aos parasitos selvagens. Análises de expressão gênica global (RNA-Seq), a partir de mRNAs obtidos de epimastigotas nocautes revelaram 12 genes com expressão diminuída nas linhagens nocautes quando comparadas com epimastigotas selvagens. Nenhum gene apresentou aumento de expressão em linhagens nocautes comparado com parasitos selvagens. A capacidade dessa RBP de interagir com o mRNA codificante para a proteína associada a diferenciação, identificado entre os genes diferencialmente expressos no RNA-Seq dos parasitos nocautes, foi confirmada em ensaios de imunoprecipitação de RNA. Sabendo que a população de T. cruzi é altamente heterogênea com cepas apresentando diferentes características biológicas, bioquímicas e moleculares, buscamos estudar a expressão de RBPs não somente no clone CL Brener de T. cruzi, o qual apresenta alta virulência em modelos de infecção, mas também no clone CL-14, o qual é totalmente avirulento. Para investigar os mecanismos regulatórios que controlam a transcrição de genes que controlam a diferenciação das amastigotas intracelulares em tripomastigotas extracelulares procuramos por RBPs que são diferencialmente expressas durante a infecção de células com os clones CL Brener e CL-14 do T. cruzi. Dentre os sete transcritos diferentemente expressos durante o ciclo intracelular, a RBP codificada pelo gene TcCLB.507611.300, contendo o motivo RRM, foi o único que apresentou expressão diferencial entre os clones CL Brener e CL-14. Essa RBP é três vezes mais expressa em tripomastigota de CL-14 comparado à tripomastigota de CL Brener, sugerindo que possa ter um papel regulatório relacionado ao fenótipo não virulento de CL-14.