Isolamento, caracterização termodinâmica e estudos bioquímicos da lectina de sementes dormentes e de cotilédones de sementes germinadas da leguminosa Macrotyloma axillare

• Autor(a) principal: Marcos Aurelio de Santana
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/CMFC-7P5NU2
• topic: Macrotyloma axillare; Dicotiledonea; Bioquímica; Macrotiloma; Lectinas Termodinâmica; Leguminosa; Lectinas Isolamento

A lectina da Macrotyloma axillare (LMA) é uma lectina N-acetilgalactosamina específica muito importante em biotecnologia uma vez que pode ser utilizada para biotipagem de hemácias humanas do Subgrupo A1. Neste trabalho, a LMA proveniente de sementes dormentes e germinadas foi purificada por uma nova técnica, utilizando métodos de precipitação e cromatografia de troca iônica. Por tal metodologia isolaram-se três frações ativas da LMA (0,2; 0,3 e 0,4M) com atividade hemaglutinante sobre hemácias A1 e com rendimento em massa predominante da LMA 0,2M. Análises por SDS-PAGE 12,5% e por espectrometria de massas do tipo ESI e MALDI-TOF revelaram que as frações de LMA são semelhantes e apresentam massas moleculares de 28 1 kDa. Estudos de estabilidade em diferentes condições de pH mostraram que a LMA apresenta atividade hemaglutinante máxima entre pH 6,0-8,0 e na presença de íons divalentes como o Ca(II) e Mn(II); com decréscimo de atividade em condições ácidas/alcalinas. As determinações de massa molecular nativa da LMA por cromatografia de exclusão por tamanho demonstraram que a LMA se comporta como tetrâmero entre pH 6,0-8,0 e dímero em pH 4,0. Estudos termodinâmicos das diversas frações de LMA (sementes dormentes e germinadas) por ITC, utilizando NacGal e NO2-Fenil-NacGal derivados, revelaram que tais frações de LMA possuem afinidades similares para os diversos carboidratos testados, com ligações entalpicamente dirigidas. O carboidrato 2-NO2-Fenil--D-NacGal foi o melhor ligante para a LMA em titulações realizadas por ITC em baixas temperaturas (15°C), pH próximo à neutralidade e em altas concentrações de NaCl (1M). Os dados obtidos para a LMA de sementes germinadas demonstram que essa proteína é resistente durante o processo de germinação por 120 horas, como verificado pelas análises de espectrometrias de massas e pelas titulações calorimétricas. Estudos de desnaturação realizados por DSC revelaram que a LMA possui elevada estabilidade termodinâmica em pH 6,2 com Tm 100°C. O processo de desnaturação da LMA é irreversível (modelo dois estados) e termodinamicamente dirigido nas condições experimentais testadas no DSC. Os dados obtidos para a LMA de sementes dormentes e germinadas e a elevada resistência térmica da LMA corroboram que tais proteínas podem ser importantes na fisiologia, desenvolvimento e metabolismo das sementes da leguminosa Macrotyloma axillare.