Caracterização funcional e estrutural da proteína tuzina e de duas lipases de Trypanosoma cruzi

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Laibida, Leticia Adejani
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/69460
Resumo: Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da Rocha
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spelling Laibida, Leticia AdejaniFragoso, Stenio PerdigãoUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Rocha, Wanderson Duarte da2021-02-23T22:03:34Z2021-02-23T22:03:34Z2016https://hdl.handle.net/1884/69460Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da RochaCoorientador : Dr. Stenio Perdigão FragosoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 22/09/2016Inclui referências : f. 130-143Resumo: O primeiro genoma publicado de Trypanosoma cruzi, o agente causal da doença de Chagas, foi do clone CL Brener, em 2005, e depois de mais de dez anos, por volta de 50% de seus genes ainda têm função desconhecida. Dentre eles, os genes de tuzina e de duas lipases foram parcialmente caracterizados neste trabalho. Tuzina é uma proteína de baixa expressão presente em T. cruzi, e com domínio de ligação a ATP. Seus genes alternam-se em blocos com os de amastinas, uma família de proteínas de superfície associada à virulênica neste organismo. Análises in silico conduzidas neste trabalho mostraram que tuzinas de T. cruzi são mais conservadas com as de Trypanosoma brucei, Trypanosoma evansi e Trypanosoma grayi (> 80% de identidade). No entanto, menor conservação é observada em Leishmania spp. (< 50%). Neste parasito, a divergência de sequências sugere o agrupamento em famílias, as quais podem exercer funções distintas neste gênero. Além da tuzina de 51 kDa descrita inicialmente, nossas análises in silico apontaram a presença de isoforma maior com 75 kDa (Tuzina-75) em T. cruzi, com cerca de 70% de identidade com a tuzina de T. brucei (74 kDa). Diferentes tentativas de superexpressão apontaram que os níveis de Tuzina-75 devem ser tão baixos quanto os de Tuzina-51, o que dificultou sua caracterização. Dados de localização subcelular de Tuzina-51 fusionada à etiqueta de FLAG apresentaram aspecto difuso por todo parasito, no entanto, a proteína fusionada estava presente tanto na fração citoplasmática, quanto na de membrana deste organismo. A fim de fornecer indícios da função de TcTuzina- 51, a coimunoprecipitação de Tuzina-51 em fusão à FLAG seguida de espectrometria MS/MS foi realizada. Nessa abordagem, foram identificadas proteínas associadas ao sistema arcaico de translocação através da membrana mitocondrial externa (ATOM), e também uma proteína associada à translocação no retículo endoplasmático (RE). Estes resultados sugerem que tuzina esteja associada à translocação de proteínas nestas organelas, embora seu mecanismo ainda seja desconhecido. Quanto às lipases também estudadas aqui, uma delas foi identificada como uma fosfolipase do tipo A1 (TcPLA1), possivelmente secretada devido à presença de peptídeo sinal de endereçamento para RE. Fosfolipases já foram descritas como fatores de virulência em alguns microrganismos. A expressão de TcPLA1 foi maior em amastigotas da cepa G, a forma evolutiva mais infectiva desta cepa, sugerindo relação com sua virulência. Já a segunda lipase (TcLip2) possui um domínio FYVE de ligação ao zinco e a lipídeos de membrana, podendo estar associada à formação de endossomos primários ou a lisossomos. Tomados em conjunto, estes dados reforçam a importância para a caracterização destas proteínas, uma vez que o complexo ATOM foi descrito recentemente em T. brucei, e parece muito divergente de outros eucariotos, o que os torna pontenciais alvos de drogas. Por conseguinte, a biogênese endossomal em T. cruzi ainda não foi completamente caracterizada e talvez TcLip2 pode estar envolvida nesse processo. Finalmente, o conhecimento da função destas proteínas poderá fornecer maiores evidências sobre a biologia celular e molecular deste protozoário, e, consequentemente, sobre a virulência de T. cruzi e seu papel na doença de Chagas. Palavras chave: ATOM. Lipases. Translocon. Trypanosoma cruzi. Tuzina.Abstract: The first genome published for Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, was for the CL Brener clone, in 2005, and over than ten years after, about 50% of its genes still have unknown function. Among them, tuzin and two lipases were partially characterized in this study. Tuzin is a low expression protein from T. cruzi, which contains a domain for ATP binding. Tuzin genes alternate in a cluster with amastins', a surface protein family associated with the virulence in this organism. In silico analysis carried on this study showed that tuzin from T. cruzi has higher conservation when compared to Trypanosoma brucei, Trypanosoma evansi and Trypanosoma grayi (> 80% identity). However, lower conservation was observed in Leishmania spp. (< 50%). In this parasite, the sequence divergence of tuzin suggests its grouping into families, which could play different roles in this genre. In addition to 51 kDa tuzin previously described, our in silico analysis indicated the existence of an isoform in T. cruzi with 75 kDa (Tuzin-75), with about 70% identity to T. brucei (74 kDa). Different attempts for overexpression of this isoform led the conclusion that Tuzin-75 expression levels should be as low as Tuzin-51's, thus, hampering its characterization. Subcellular location data of Tuzin-51 fused to FLAG epitope showed scattered location over the parasite's body, however, the fused protein was identified in both subcellular fractions, cytoplasm and membrane. In order to provide TcTuzina- 51 function indications, co-immunoprecipitation of Tuzin-51 fused to FLAG followed by MS/MS spectrometry was performed. In this approach, we have identified proteins associated with the mitochondrial archaic translocase of the outer membrane (ATOM) and with the endoplasmic reticulum (ER) translocon. These results suggest a possible correlation with tuzin to protein translocation in these organelles, although its mechanism remains unknown. For the lipases also studied here, one of them was identified as a phospholipase A1 (TcPLA1), possibly secreted due to a signal peptide targeting to the ER. Phospholipases were already described as virulence factors in some microorganisms. TcPLA1 expression was higher in amastigote cells from T. cruzi G strain, the most infective form for this strain, which suggests correlation with its virulence. In the last protein studied, the lipase TcLip2, we have found a FYVE domain for lipid membranes and zinc binding, which indicates association to early endosomes or lysosomes formation. Taken together, these data reinforce the importance for these proteins characterization, once the ATOM complex was recently described in T. brucei and seems to be very divergent from other eukaryotes, making this complex a putative target for new drugs. Additionally, the early endosome biogenesis in T. cruzi was not characterized yet, and maybe TcLip2 should be involved in this process. Finally, revealing these proteins functions may contribute to the further evidence for the molecular and cellular biology of T. cruzi, and, consequently, for the virulence of this protozoa and its role in Chagas disease. Key words: ATOM. Lipase. Translocon. Trypanosoma cruzi. Tuzin.151 f. : il., algumas color., tabs., grafs.application/pdfDisponível em formato digitalBioquímicaTripanossoma cruziLipaseCaracterização funcional e estrutural da proteína tuzina e de duas lipases de Trypanosoma cruziinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - LETICIA ADEJANI LAIBIDA.pdfapplication/pdf6986825https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/69460/1/R%20-%20T%20-%20LETICIA%20ADEJANI%20LAIBIDA.pdff36a1e2ed42082c081c3e05f8b844127MD51open access1884/694602021-02-23 19:03:34.316open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/69460Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082021-02-23T22:03:34Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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