Internalização e tráfego da Stress Inducible Protein-1 (STI-1), um ligante da proteína prion celular
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2006 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFMG |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/1843/SMOC-6WLPET |
Resumo: | A proteína prion celular (PrPc) é uma glicoproteína ligada à membrana plasmática por uma âncora de GPI (glicosilfosfatidilinositol). A sua isoforma anormal (PrPsc) é uma molécula infecciosa envolvida na patogênese das doenças priônicas. A identificação de vários ligantes que interagem com PrPc tem auxiliado no entendimento das funções fisiológicas desta proteína. Um destes ligantes é a STI-1 (stress inducible protein 1), cuja interação com PrPc induz a neuroproteção e neuritogênese por distintas vias de sinalização. A STI-1 é uma co-chaperona que também pode atuar como um fator neurotrófico solúvel. Para melhor compreender as funções fisiológicas de PrPc e STI-1, estudamos a interação celular e o tráfego de STI-1. Neste trabalho caracterizamos a interação da STI-1 recombinante com células SN56, e mostramos que esta interação ocorre através de um sítio de ligação saturável e específico. Observamos que a interação da STI-1 com as células SN56 leva à internalização de STI-1. Experimentos de dupla marcação utilizando STI-1 fluorescente e clatrina-GFP mostraram que a principal via de internalização de STI-1 é independente de clatrina. Avaliamos também se a STI-1 era direcionada para endosomas primários após sofrer endocitose. Para isso utilizamos os marcadores de endosomas primários Transferrina e Rab5-GFP. Os resultados dos experimentos de co-localização entre STI-1 fluorescente e transferrina Alexa Fluor488 ou Rab5-GFP sugerem que a STI-1 não é direcionada para endosomas primários após ser internalizada. A partir deste resultado, avaliamos a presença de STI-1 em vesículas acídicas através de experimentos de dupla marcação utilizando Lysosensor Green. Os resultados mostraram alta co-localização entre STI-1 e Lysosensor, sugerindo o direcionamento de STI-1 para vesículas acídicas.Para identificarmos a identidade destas vesículas utilizamos o mutante constitutivamente ativo Rab7Q67L como marcador de endosomas tardios/lisosomas. Os experimentos de co-localização mostraram que a maior parte das vesículas positivas para STI-1 eram positivas para Rab7Q67L, sugerindo o direcionamento de STI-1 para endosomas tardios/lisosomas. Conjuntamente, os resultados deste trabalho fortemente sugerem que a STI-1 interage com um sítio específico na membrana plasmática, sendo internalizada principalmente por uma via independente de clatrina e direcionada para endosomas tardio/lisosomas sem passar por endosomas primários |
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Marco Antonio Maximo PradoMarcus Vinicius GomezCristina Guatimosim FonsecaFabiana Andrade Caetano2019-08-12T00:48:57Z2019-08-12T00:48:57Z2006-10-27http://hdl.handle.net/1843/SMOC-6WLPETA proteína prion celular (PrPc) é uma glicoproteína ligada à membrana plasmática por uma âncora de GPI (glicosilfosfatidilinositol). A sua isoforma anormal (PrPsc) é uma molécula infecciosa envolvida na patogênese das doenças priônicas. A identificação de vários ligantes que interagem com PrPc tem auxiliado no entendimento das funções fisiológicas desta proteína. Um destes ligantes é a STI-1 (stress inducible protein 1), cuja interação com PrPc induz a neuroproteção e neuritogênese por distintas vias de sinalização. A STI-1 é uma co-chaperona que também pode atuar como um fator neurotrófico solúvel. Para melhor compreender as funções fisiológicas de PrPc e STI-1, estudamos a interação celular e o tráfego de STI-1. Neste trabalho caracterizamos a interação da STI-1 recombinante com células SN56, e mostramos que esta interação ocorre através de um sítio de ligação saturável e específico. Observamos que a interação da STI-1 com as células SN56 leva à internalização de STI-1. Experimentos de dupla marcação utilizando STI-1 fluorescente e clatrina-GFP mostraram que a principal via de internalização de STI-1 é independente de clatrina. Avaliamos também se a STI-1 era direcionada para endosomas primários após sofrer endocitose. Para isso utilizamos os marcadores de endosomas primários Transferrina e Rab5-GFP. Os resultados dos experimentos de co-localização entre STI-1 fluorescente e transferrina Alexa Fluor488 ou Rab5-GFP sugerem que a STI-1 não é direcionada para endosomas primários após ser internalizada. A partir deste resultado, avaliamos a presença de STI-1 em vesículas acídicas através de experimentos de dupla marcação utilizando Lysosensor Green. Os resultados mostraram alta co-localização entre STI-1 e Lysosensor, sugerindo o direcionamento de STI-1 para vesículas acídicas.Para identificarmos a identidade destas vesículas utilizamos o mutante constitutivamente ativo Rab7Q67L como marcador de endosomas tardios/lisosomas. Os experimentos de co-localização mostraram que a maior parte das vesículas positivas para STI-1 eram positivas para Rab7Q67L, sugerindo o direcionamento de STI-1 para endosomas tardios/lisosomas. Conjuntamente, os resultados deste trabalho fortemente sugerem que a STI-1 interage com um sítio específico na membrana plasmática, sendo internalizada principalmente por uma via independente de clatrina e direcionada para endosomas tardio/lisosomas sem passar por endosomas primáriosThe cellular prion protein (PrPc) is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored plasma membrane glycoprotein. The PrPc abnormal isoform, PrPsc, is an infectious form involved in the prion disease pathogenesis. Identification of ligands that interact with PrPc can help in the understanding the physiological function of this protein. The STI-1 (stress inducible protein 1) is a specific PrPc ligand that promotes neuroprotection and neuritogenesis by distinct signaling pathways. STI-1 is a co-chaperone that can act as a soluble neurotrophic factor. In order to understand possible physiological functions of STI-1 and PrPc we investigated the cellular interactions and intracellular trafficking of STI-1. In this work, we characterized the interaction of recombinant STI-1 with SN56 cells and showed that this interaction is mediated by a specific and saturable binding site in SN56 cells. We observed that the interaction between STI-1 and SN56 cells promotes STI-1 internalization. Double labeling experiments using fluorescent STI-1 and clathrin-GFP indicated that the major endocytic pathway to the STI-1 internalization is clathrin independent. Next, our aim was to evaluate wether the STI-1 was targeted to early endosomes after endocytosis. To test this hypothesis, we used two markers of early endosomes: Transferrin and Rab5-GFP. The experiment of co-localization between STI-1 and Alexa Fluor 488-Transferrin or Rab5-GFP suggested that STI-1 is not targeted to early endosomes after endocytosis. As STI-1 was not found in early endosomes, we decided to evaluate if STI-1 is found in acidic vesicles. To this purpose we used Lysosensor Green labelling. The result indicated strong co-localization between STI-1 and Lysosensor, suggesting that STI-1 is target to acidic vesicles. To identify these vesicles, we used the constitutively active mutant Rab7Q67L, a late endosome/lysosome marker. The co-localization studies showed that the most STI-1 positive vesicles were positives to Rab7Q67L-positives suggesting that STI-1 is targeted to late endosomes/lysosomes. Taken together, our results indicate that STI-1 binds to cells in a saturable and specific way, it is internalized by a clathrin independent pathway and is targeted to late endosomes/lysosomes bypassing therefore early endosomesUniversidade Federal de Minas GeraisUFMGProteína de ligaçãoFarmacologiaChaperonasProteína Prion CelularTráfegoInternalização e tráfego da Stress Inducible Protein-1 (STI-1), um ligante da proteína prion celularinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALdissertacao_fabiana.pdfapplication/pdf4522529https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/SMOC-6WLPET/1/dissertacao_fabiana.pdf64777ff7885a195be59bb90b4fb9eb16MD511843/SMOC-6WLPET2019-08-11 21:48:57.824oai:repositorio.ufmg.br:1843/SMOC-6WLPETRepositório de PublicaçõesPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-08-12T00:48:57Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false |
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