Estudo dos mecanismos de alcalinização intestinal em fêmeas de Lutzomyia longipalpis (Diptera:Psychodidae)

• Autor(a) principal: Denise Barguil Nepomuceno
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/31776
• topic: Lutzomyia longipalpis; pH; Intestino médio; LULOPAT1; Sistema TOR; Lutzomyia; Intestinos - parasitos; Alcalinização

Lutzomyia longipalpis é um díptero hematófago que atua como principal vetor de protozoários do gênero Leishmania nas Américas. Considerando que, no inseto vetor, o desenvolvimento de Leishmania é exclusivamente no tubo digestivo, estudos sobre a fisiologia intestinal destes insetos, especialmente do controle do pH intestinal, tornam-se indispensáveis. Os mecanismos que ativam a alcalinização do intestino médio, quando as fêmeas deixam de se alimentar de açúcares e fazem repasto sanguíneo, ainda não foram plenamente elucidados. Sabe-se que o transporte diferencial de íons, evento comum às células do tubo digestivo e associado à energização das membranas, com o transporte de nutrientes e com o controle do pH no meio, pode ser ativado a partir da sinalização conduzida por segundos mensageiros intracelulares. Sistemas de transporte de aminoácidos são cruciais na fisiologia de dípteros hematófagos, e alguns transportadores funcionam fazendo simporte de íons H+ com aminoácidos. Propõe-se, então, que estes transportadores podem estar envolvidos na regulação do pH intestinal. Além disso, o sistema TOR, uma via de sinalização intracelular altamente conservada entre os organismos eucariotos, é especialmente ativado pela presença de aminoácidos; uma vez que a digestão do sangue é um processo essencialmente enzimático e gera aumento da concentração de aminoácidos, é possível que esse sistema seja ativado mediante o repasto sanguíneo e participe da alcalinização intestinal. Contudo, não há estudos abordando tais aspectos em L. longipalpis. Desta forma, este trabalho objetivou estudar os mecanismos que atuam no controle da alcalinização intestinal em fêmeas de L. longipalpis. A partir de preparações ex-vivo, intestinos de fêmeas de L. longipalpis corados com azul de bromotimol, e, sabidamente em pH≤ 6, foram tratados com diferentes concentrações de uma solução de aminoácidos. Verificou-se que a presença de aminoácidos estimulava a alcalinização, mas a intensidade do processo variava com a concentração utilizada. Mediante a elaboração de uma metodologia mais sensível para avaliar alterações de pH intestinal a partir da presença de aminoácidos, passou-se a utilizar o corante fluoresceína, cuja emissão de fluorescência varia com o pH do meio. Em intestinos abertos, onde o corante estava presente apenas no citoplasma dos enterócitos, a adição da solução de aminoácidos provocou significativa redução da fluorescência emitida, evidenciando precisamente que íons H+ foram transportados do lúmen intestinal para o citoplasma dos enterócitos, culminando na acidificação desse compartimento. Em intestinos fechados a aplicação da solução de aminoácidos induziu o aumento da emissão de fluorescência, o que está em acordo com o fato que a acidificação do citoplasma dos enterócitos necessariamente implica na alcalinização do lúmen intestinal. A investigação da participação de transportadores de aminoácidos levou à identificação de LULOPAT1, um transportador especializado no simporte aminoácidos/H+, expresso apenas no intestino e modulado pelo estado nutricional de L. longipalpis, havendo aumento significativo de expressão logo após o repasto sanguíneo. LULOPAT1 é localizado na superfície apical do intestino, o que está em acordo com o fato de que apenas em intestinos abertos a entrada de aminoácidos pelo lúmen intestinal era possível, resultando na acidificação do citoplasma dos enterócitos. Outros transportadores estão envolvidos na entrada de aminoácidos através da membrana basolateral dos intestinos, e serão investigados em estudos futuros. A avaliação do papel de ATPases na geração de um gradiente eletroquímico através de membranas em fêmeas com repasto sanguíneo evidenciou que a principal bomba eletrogênica envolvida nesse processo seria a Na+/K+-ATPase. Na presença de ouabaína, inibidor específico de Na+/K+-ATPase, a atividade enzimática total reduziu significativamente de 1,186±0,340µmol PO43− h−1 à 0,416±0,0596µmol PO43− h−1 (p<0,05), indicando que ela seria responsável por mais de 60% da atividade total medida. Ao avaliarmos o efeito da hemolinfa de fêmeas com repasto sob o pH intestinal, verificou-se que a hemolinfa coletada no intervalo de 0-3 horas após repasto sanguíneo promoveu intenso estímulo à alcalinização em relação ao intervalo 30-33 horas. Em fases mais avançadas da digestão a concentração de moléculas alcalinizantes decresceria, mas a atividade de enzimas proteolíticas seria máxima, com maior quantidade de aminoácidos sendo absorvidos pelos enterócitos, o que contribuiria para a manutenção do pH alcalino. Ao avaliarmos a participação do sistema TOR no controle de pH intestinal, inicialmente identificou-se a sequência do gene 4E-BP, um dos principais alvos downstream de TOR. A ativação de TOR necessariamente implica na fosforilação de 4E-BP, e os experimentos de western blotting com o anticorpo Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) permitiram evidenciar que a proteína era intensamente fosforilada nas primeiras horas após repasto sanguíneo. Ao avaliarmos uma possível associação entre ativação de TOR e alcalinização induzida pela presença de aminoácidos e pela hemolinfa de fêmeas com repasto, utilizou-se intestinos ácidos (pH≤6), corados com azul de bromotimol, previamente tratados com rapamicina (inibidor específico de TOR). A inibição do sistema TOR não afetou a alcalinização intestinal estimulada por aminoácidos, mas afetou intensamente o efeito da hemolinfa de fêmeas com repasto, sugerindo que o estímulo à elevação do pH intestinal na presença de aminoácidos ocorre também por outros sistemas que não TOR. Ao estudarmos a possível participação de cAMP e cGMP no controle de pH intestinal, utilizando preparações ex-vivo de intestinos ácidos (pH≤6), contendo azul de bromotimol, verificou-se que a presença de cAMP induziu a alcalinização intestinal, enquanto cGMP não produziu quaisquer alterações. Por outro lado, em intestinos previamente alcalinizados por ingestão de soro inativado, cAMP não interferiu no pH intestinal, mas o tratamento com cGMP acidificou o lúmen intestinal. O estudo realizado desvendou mecanismos que participam ativamente na regulação do pH intestinal, além de propor novas vias que podem ter influência nesse processo, expandindo sobremaneira os conhecimentos existentes da fisiologia digestiva de L. longipalpis. Espera-se em breve ser possível elaborar um modelo de funcionamento que contemple todos os mecanismos envolvidos no controle do pH intestinal em L. longipalpis.