Reparo de DNA em dois patógenos humanos: caracterização do gene IMP4 de Schistosoma mansini e estudos acerca do MMR, Sistema GO e taxa de mutação em Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: Carolina Furtado Torres da Silva
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/UCSD-8FVPH6
• topic: Schistosoma mansoni; MMR; IMP4; Trypanosoma cruzi; Bioquímica e imunologia

O conteúdo genético de um organismo está continuamente exposto a agentes que danificam a molécula de DNA, causando mutações ou comprometendo suas funções. Complexos mecanismos de reparo ou tolerância a danos no DNA ajudam a manter baixas as taxas de mutação em uma célula e a garantir a integridade do seu genoma. Neste trabalho, estudamos o reparo de DNA em dois parasitos humanos, Schistosoma mansoni e Trypanosoma cruzi, causadores da esquistossomose e da Doença de Chagas no Brasil. Esses parasitas são expostos a diferentes agentes genotóxicos ao longo do ciclo de vida e necessitam, portanto, apresentar diversos mecanismos de adaptação. Através da estratégia de complementação funcional heteróloga, isolamos um cDNA de S. mansoni capaz de complementar bactérias deficientes na via de reparo por excisão de bases (BER). O sequenciamento do cDNA indicou homologia ao gene ScIMP4 de Saccharomyces cerevisiae, que está envolvido no metabolismo de RNA. Construímos uma linhagem mutante de S. cerevisiae, que codifica a proteína IMP4 truncada e verificamos que esta apresenta sensibilidade acentuada a MMS. Observamos ainda que o gene IMP4 de S. mansoni foi capaz de complementar parcialmente a levedura mutante, indicando homologia funcional entre os genes IMP4 do verme e da levedura. Na segunda etapa deste trabalho, estudamos mecanismos de reparo de DNA possivelmente associados à geração de variabilidade genética em T. cruzi. Nosso grupo demonstrou previamente a existência de três isoformas (A, B e C) da proteína TcMSH2 em T. cruzi. Esta proteína é o principal componente da via de reparo de erros de pareamento (MMR) em eucariotos. Através de ensaios in vivo com cisplatina, MNNG e H2O2, na presença de cloreto de cádmio (em concentrações que inibem especificamente o MMR), obtivemos novos indícios de que as cepas que codificam a isoforma A de TcMSH2 apresentam MMR mais eficiente, quando comparadas a cepas que codificam a isoforma C desta proteína, e isto pode estar relacionado com a maior variabilidade genética vista nas últimas. Para estudar mecanismos de resposta a danos oxidativos em T. cruzi, caracterizamos o possível ortólogo de OGG1 no parasito. Vimos que a expressão do alelo TcOgg1A é tóxica em bactérias e que a superexpressão deste no clone CL Brener aumenta sua sensibilidade ao tratamento com H2O2. Ainda, realizamos uma busca por homólogos funcionais de MutT em T. cruzi. Nossos resultados indicam que os alelos Ndx1 e Ndx4, que apresentam o domínio Nudix, não complementam bactérias deficientes em MutT. Também observamos que a superexpressão de EcMutT em T. cruzi aumenta a sobrevivência dos parasitos em resposta ao tratamento com H2O2 e reduz os níveis de 8-oxoG após estresse oxidativo. Finalmente, desenvolvemos um sistema repórter capaz de avaliar a taxa de mutação em T. cruzi. O ensaio, realizado em meio semi-sólido, baseia-se na seleção de mutantes resistentes a neomicina, que revertem uma mutação inserida no gene neo introduzido no genoma do parasito. Os resultados obtidos em um ensaio preliminar indicam a viabilidade da metodologia, através da qual seremos capazes de determinar a taxa de mutação em diferentes cepas de T. cruzi, assim como avaliar o efeito de diferentes agentes mutagênicos no parasita.