MSH2 e o reparo de erros de pareamento em tripanossomatídeos: análises in vitro e in vivo e envolvimento na resposta a estresse oxidativo

• Autor(a) principal: Alice Machado da Silva
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/CMFC-7FNMEZ
• topic: tripanossomatídeos; Bioquímica; Tripanossoma cruzi; Reparo de erro de pareamento de DNA; DNA Recombinante; Estresse oxidativo

Estudos recentes realizados pelo nosso grupo demonstraram que a espécie Trypanosoma cruzi pode ser dividida em três haplogrupos distintos, denominados A, B e C. Essa classificação está baseada em uma extensa análise de microssatélites e polimorfismos de vários genes em diversas cepas desse parasita, incluindo o gene MSH2, que codifica um componente essencial da via de reparo de erros de pareamento (MMR). Tratamento com agentes genotóxicos sugeriu que cepas dos haplogrupos B e C apresentam menor eficiência de MMR se comparado com cepas do haplogrupo A. Esses resultados nos levaram a propor que essa menor eficiência de MMR poderia estar correlacionada à maior variabilidade genética encontrada nessas cepas, como demonstrado em estudos recentes sobre famílias de genes multi-cópias. Cabe notar que as cepas pertencentes ao haplogrupo C estão normalmente associadas aos casos crônicos da doença de Chagas no Brasil. Portanto, é possível que essa maior variabilidade genética tenha contribuído para uma maior capacidade de adaptação dessas cepas ao ciclo doméstico da doença de Chagas. Como cada um dos haplogrupos é caracterizado por uma isoforma distinta de MSH2, decidimos aprofundar a caracterização dessa proteína e investigar se ela poderia ser responsável pelas possíveis diferenças de MMR entre haplogrupos. O MSH2 foi amplificado a partir de DNA genômico das cepas de T. cruzi Colombiana (haplogrupo A) e CL Brener (uma cepa híbrida apresentando os alelos de MSH2 dos haplogrupos B e C) e sua região codificadora foi seqüenciada. Foram encontradas 29 substituições de aminoácidos entre o MSH2 dessas cepas, algumas delas em regiões descritas como importantes para a manutenção da estrutura ou função dessa proteína. Análises in silico indicaram que as diferenças entre o MSH2 de Colombiana e CL Brener não levam a alterações estruturais. Visando verificar sua atividade in vitro, o MSH2 dessas cepas foi expresso em E. coli e as proteínas recombinantes utilizadas em um ensaio funcional de hidrólise de ATP. A proteína MSH2 de Colombiana apresentou maior atividade ATPásica in vitro quando comparada à de CL Brener, sugerindo que os SNPs encontrados podem ser responsáveis pelas diferenças observadas nas respostas a tratamentos com agentes genotóxicos. Visando comparar a atividade do MSH2 de CL Brener e Colombiana in vivo optamos pela expressão heteróloga dessas isoformas de MSH2 de T. cruzi em linhagens de Trypanosoma brucei MSH2 -/-. Entretanto, as análises de instabilidade de microssatélite e tratamento com MNNG indicaram que a complementação da via de MMR em T. brucei através da expressão de MSH2 de T. cruzi não é possível. Por outro lado, esse modelo nos permitiu avaliar a participação do MSH2 na resposta ao estresse oxidativo nesse parasita. Semelhante ao observado com linhagens de T. cruzi MSH2+/-, linhagens de T. brucei MSH2 -/- são mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) do que células selvagens. Ensaios com células de T. brucei MLH1-/- demonstraram que MLH1, uma proteína que atua juntamente com o MSH2 no MMR, não está envolvida nesse processo. O fato do MSH2 de T. cruzi não ter sido capaz de complementar a via de MMR em T. brucei MSH2 -/-, associado à não participação do MLH1 na resposta a tratamento com H2O2, nos levou a propor que, em tripanossomatídeos, MSH2 teria um papel adicional na resposta a estresse oxidativo, sendo essa uma função independente do MMR.