Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quatificação de clofazimina e dapsona em plasma humano

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Concentino, Victor
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/65983
Resumo: Orientador: Prof. Dr. Roberto Pontarolo
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spelling Campos, Michel Leandro deUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasPontarolo, Roberto, 1954-Concentino, Victor2024-02-08T16:02:14Z2024-02-08T16:02:14Z2019https://hdl.handle.net/1884/65983Orientador: Prof. Dr. Roberto PontaroloCoorientador: Prof. Dr. Michel Leandro CamposDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 26/07/2019Inclui referências: p. 73-79Resumo: Hanseníase é uma doença infectocontagiosa causada pelo complexo Mycobacterium leprae (M. leprae e M. lepratomatosis) que acomete a pele e o sistema nervoso periférico e possui como principal característica a presença de lesões hipopigmentadas ou avermelhadas, com eventual perda da sensibilidade local. Com o intuito de aprimorar o tratamento e evitar o desenvolvimento de resistência bacteriana, em 1981 a OMS instituiu a utilização da poliquimioterapia (PQT), associando dapsona a clofazimina e a rifampicina, sua utilização mostrou-se altamente efetiva no tratamento da hanseníase, levando rapidamente o paciente a um quadro não infeccioso contribuindo para a redução considerável do número de casos de hanseníase. Porém a taxa de detecção de novos casos tem se mantido constante nos últimos anos, sendo necessário a realização de ações no aprimoramento do tratamento da hanseníase como a monitorização terapêutica, que permite possíveis ajustes de doses e pode contribuir para explicar possíveis falhas no tratamento. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e validar um método por CLAEEM/ EM para quantificação de clofazimina e dapsona em plasma humano visando a sua aplicação na monitorização terapêutica. As amostras foram preparadas utilizandose o protocolo de extração por precipitação de proteínas com acetonitrila. Utilizou-se um cromatógrafo a liquido de alta eficiência Agilente 1200 acoplado a um espectrômetro de massas do tipo Triplo Quadrupolo API 3200 Applied Biosystems, provido de fonte de ionização Electrospray (ESI), operado no modo positivo de ionização. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna XTerra MS C18 150 x 2,1 mm, 3,5 ?m, utilizando como fase móvel uma mistura de água:acetonitrila:ácido fórmico (40:60:0,1; v/v/v), em modo isocrático com fluxo de 400 ?L/min. O método desenvolvido e validado mostrou-se seletivo, livre de efeito residual e efeito matriz. Os limites de quantificação (50 ng/mL para a clofazimina e 100 ng/mL para a dapsona) demonstram que a sensibilidade do método é adequada para a utilização proposta. As curvas de calibração apresentaram uma excelente correlação (r ? 0,99) nas faixas de 0,05 a 5,00 ?g/mL para a clofazimina e 0,10 a 10,00 ?g/mL para a dapsona. Nos diferentes níveis de concentração as variações de precisão e exatidão foram menores que 15%. A recuperação dos analitos (> 80%) foi obtida com elevada reprodutibilidade (DPR% < 10%). Sob as condições normais de trabalho foi observado excelente estabilidade dos analitos tanto em plasma quanto em solução. Deste modo, os resultados obtidos pela validação indicam que o método desenvolvido está apto para ser utilizado. Palavras-chave: Hanseníase; Clofazimina; Dapsona; CLAE-EM/EM; Monitorização Terapêutica.Abstract: Leprosy is an infectious disease caused by the Mycobacterium leprae (M. leprae and M. lepratomatosis) complex that affects the skin and peripheral nervous system and has as main characteristic the presence of hypopigmented or reddish lesions with possible loss of local sensitivity. In order to improve treatment and avoid the development of bacterial resistance to dapsone, in 1981 the WHO instituted the use the multidrug therapy (MDT), associating dapsone with clofazimine and rifampicin. The use of MDT was highly effective in the treatment of leprosy, being able to quickly take the patient to a non-infectious setting, leading to a considerable reduction in the number of cases of leprosy. However, the rate of detection of new cases has remained constant in recent year. Thus, it is necessary to perform actions to improve the treatment of leprosy. One of the tools that can be used for this purpose is therapeutic monitoring, which allows to possible dose adjustments and explains possible treatment failures. Therefore, the objective of the present work was to develop and validate a method according to the main bioanalytical guidelines, using HPLC-MS/MS for the quantification of clofazimine and dapsone in human plasma, aiming at its application in therapeutic monitoring. The samples were processed using protein precipitation with acetonitrile extraction protocol. An Agilent 1200 high performance liquid chromatography system coupled with a API 3200 Applied Biosystems mass spectrometer, provided with Electrospray ionization source (ESI), operated in positive ionization mode. Chromatographic separation was achieved on a X-Terra MS C18 column (150 x 2.1 mm, 3.5 ?m), using as mobile phase a mixture of water:acetonitrile:formic acid (40:60:0,1; v/v/v), in isocratic mode with flow of 400 ?L/min. The analytes were analyzed in the positive ionization mode using electrospray as the ionization source. The validation results showed the developed method is selective, free of residual and matrix effect. Quantification limits (50 ng/mL for clofazimine and 100 ng/mL for dapsone) demonstrate the de sensitivity of the method is adequate for the proposed use. The calibration curves showed an excellent correlation (r ? 0.99) in the ranges of 0.05 to 5.00 ?g/mL for clofazimine and 0.10 to 10.00 ?g/mL for dapsone. At different levels of concentrations, the variations of precision and accuracy were less than 15%. The recovery of the analytes (> 80%) showed high reproducibility (RSD% < 10%). Under normal working conditions, excellent stability of the analytes was observed in both plasma and solution. In the way, the results obtained by the validation shows that the developed method is apt to be used. Keywords: Leprosy; Clofazimine; Dapsone; HPLC-MS/MS; Therapeutic Monitoring.1 recurso online : PDF.application/pdfHanseníaseFarmáciaDesenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para quatificação de clofazimina e dapsona em plasma humanoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - D - VICTOR CONCENTINO.pdfapplication/pdf1837040https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/65983/1/R%20-%20D%20-%20VICTOR%20CONCENTINO.pdfbe4014d737049e40afaeb14f45f8a487MD51open access1884/659832024-02-08 13:02:14.352open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/65983Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082024-02-08T16:02:14Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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