Implantação de técnicas para avaliação da dinâmica mitocondrial por microscopia confocal no Centro de Microscopia Eletrônica da UFRGS

• Autor(a) principal: Biehl, Henrique Beck
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/54442
• topic: Microscopia eletrônica

O microscópio confocal apresenta grande vantagem para o estudo de tecidos e células que requerem imagens em grande detalhamento com o controle dos diversos parâmetros de aquisição de imagem. As mitocôndrias são organelas celulares dinâmicas que possuem um ciclo complexo que envolve os processos de fissão, fusão e biogênese mitocondrial. O Resveratrol (RSV) é uma fitoalexina que tem sido utilizada para fins terapêuticos devido às evidências que mostram um possível efeito antioxidante nas células. A ativação das células estreladas hepáticas (Hepatic Stellate Cells - HSC) está relacionada com o aumento da proliferação e da produção de matriz extracelular que resulta no desenvolvimento da fibrose hepática. Em nossos trabalhos anteriores, 50μM de RSV induziu estresse oxidativo e morte celular em 24 horas de tratamento, efeito que foi atenuado em 120 horas. No presente trabalho, foram realizados tratamentos com concentrações crescentes de RSV (1, 10 e 50μM) em culturas de células da linhagem GRX, modelo de HSC. Através de diferentes técnicas de análise de imagens de microscopia confocal e utilizando diferentes marcadores fluorescentes, estudou-se a formação de espécies reativas de oxigênio, a relação entre massa mitocondrial versus sua atividade, alterações na morfologia dessa organela, sua distribuição celular e sua fagocitose (mitofagia). Pela quantificação da fluorescência do marcador DCF®, evidenciou-se que doses crescentes de RSV induz um aumento de espécies reativas de oxigênio. Utilizando as sondas fluorescentes Mito Tracker® Green e Mito Tracker® Orange, que marcam, respectivamente, massa e potencial de membrana mitocondrial, foi possível atestar que a massa mitocondrial permanece constante, mas que a atividade dessa organela diminui com o aumento da dose de RSV. Da mesma forma, foi possível observar que o tratamento com RSV induziu alteração de morfologia e redistribuição das mitocôndrias ao longo do citoplasma da GRX, comparado ao grupo controle que apresenta mitocôndrias perinucleares. Pela análise de co-localização entre os marcadores Mito Tracker® Green e LysoTracker® Red, marcador de lisossomas, evidenciou-se que o RSV induziu mitofagia. As análises de imagens obtidas por microscopia confocal se mostraram úteis na avaliação do comportamento e resposta das mitocôndrias em relação às diferentes concentrações de RSV. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por meio de técnicas quantitativas, como citometria de fluxo e ensaios espectrofluorimétricos, e mostram que a microscopia confocal, associada às ferramentas de análise de imagens, também pode ser importante na obtenção de dados quantitativos.