Clonagem molecular, expressão e caracterização da transglutaminase de Paenibacillus sp. JDR-2 em Escherichia coli

• Autor(a) principal: Barreto, Matheus Quintana
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/183883
• topic: Paenibacillus; Transglutaminase; Expressão gênica; Microbial transglutaminase; JDR-2; Paenibacillus sp

Transglutaminases são proteínas que catalisam a formação de uma ligação cruzada entre uma amina primária e o grupamento carboxamida presente em resíduos de glutamina, possuindo um importante papel na re-estruturação de alimentos proteináceos na indústria de alimentos. Paenibacillus sp. JDR-2 é uma bactéria Gram-positiva relacionada filogeneticamente com outros microrganismos produtores de transglutaminases, como aqueles do gênero Bacillus, sendo, portanto, um possível produtor desta enzima. Estre trabalho visou a identificar genes codificadores de transglutaminases presentes no genoma de Paenibacillus sp. JDR-2 in silico e expressar essas sequências em um sistema heterólogo para sua caracterização. Uma busca por genes codificadores de transglutaminases foi feita através da procura por ORFs que foram anotadas como contendo um domínio de transglutaminase e depositadas no NCBI. Primers específicos foram projetados para amplificar três destas ORFs, que foram então amplificadas por PCR e clonadas no vetor de expressão pET23d+. Os plasmídeos recombinantes gerados foram transformados em três linhagens hospedeiras de Escherichia coli para a síntese das proteínas recombinantes, cujos extratos foram analisados por SDS-PAGE e a atividade enzimática verificada pelo teste do hidroxamato. A análise in silico mostrou a presença de dez transglutaminases codificadas pelo genoma de Paenibacillus sp. JDR-2, sendo nove sequências identificadas como possíveis transglutaminases e uma destas sendo uma sequência truncada que foi, portanto, descartada de futuras análises. As sequências nucleotídicas das ORFs 4765, 4870 e 5011 foram clonadas em vetor pET23d+ e os plasmídeos recombinantes gerados foram transformados em E. coli, mas apenas com o vetor contendo a sequência da ORF 4765 transformado em E. coli Arctic Express foi observada a expressão da proteína recombinante, apesar de esta estar totalmente na fração insolúvel. Tentativas de resolubilizar a proteína 4765 utilizando condições não-desnaturantes foram eficientes, mas a proteína não mostrou qualquer atividade enzimática de transglutaminase. As próximas etapas deste trabalho envolvem a tentativa de solubilizar a proteína 4765 com um método de desnaturação protéica seguido pelo seu refolding para verificar sua atividade, e clonar as sequências 4870 e 5011 em novos vetores para expressão em E. coli e também em vetores para expressão em Pichia pastoris.