Estudos para a clonagem molecular e expressão de transglutaminase de Paenibacillus sp. JDR-2 em Pichia pastoris

• Autor(a) principal: Drescher, Carina Louise
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/149602
• topic: Transglutaminases; Paenibacillus; Bacterias gram-positivas; Pichia pastoris; Expressão gênica; Transglutaminase; Paenibacillus sp. JDR-2

A transglutaminase é uma enzima de grande importância para a indústria de alimentos, uma vez que catalisa a formação de reações de acil-transferência entre grupos γ-carboxamida em resíduos de glutamina, provocando alterações nas propriedades protéicas. O Paenibacillus sp. JDR-2 é uma bactéria gram-positiva, que está relacionada filogeneticamente com o gênero Bacillus, assim como com outros microorganismos produtores de transglutaminase, portanto, supõe-se que este é um possível produtor desta enzima. O trabalhou teve o intuito de identificar genes codificadors de transglutaminase no genoma do Paenibacillus sp. JDR-2 in silico e expressar algumas dessas sequências em sistema heterólogo. Foi realizada uma busca por genes codificadores de transglutaminase através da procura de ORFS que continham domínio de transglutaminase, estas foram anotadas e depositadas no NCBI. Foram verificadas a presença de dez possíveis transglutaminases codificadas pelo genoma do Paenibacillus sp. JDR-2, sendo que uma desta não apresentava aminoácido iniciador, e, portanto, foi descartada. As sequências 4870 e 5011 foram escolhidas para utilização neste trabalho, uma vez que o peso molecular preditos, correspondem às características encontradas nas transglutaminases bacterianas. Primers foram desenhados para a amplificação destas sequências e deveriam ser clonados no vetor pPICZα. Primeiramente, tentou-se clonar pelo método de ligação em E. coli DH10B, entretanto, as colônias formadas não apresentaram evidências que continham os insertos escolhidos. Após, foi realizada a clonagem por CPEC, já que está técnica apresenta maior especificidade. Mais uma vez a clonagem não foi efetiva, não apresentando o crescimento de colônias. Os próximos passos seriam realizar novas tentativas e, se estas fossem positivas, realizar a transformação dos plasmídeos purificados em Pichia pastoris, considerando este sistema mais eficiente para modificações pós-traducionais.