Avaliação da expressão de RIPK3 e de MLKL durante a necroptose induzida pelo vírus sincicial respiratório em macrófagos

• Autor(a) principal: Silva, Amanda Gonzalez da
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/236717
• topic: Infecções por vírus respiratório sincicial; Macrófagos; Necrose; Respiratory syncytial virus; Human orthopneumovirus; Alveolar macrophage; Mice; Thioglycolate; Clodronate; Real-time PCR; Necroptosis; RIPK3; MLKL; mRNA

Macrófagos alveolares atuam como sentinelas durante infecções respiratórias, mas podem também estar envolvidos na patogênese da infecção pelo vírus sincicial respiratório (VSR). O VSR é um vírus de RNA pertencente à família Pneumoviridae e é um importante agente etiológico de bronquiolite em crianças. A necrose é um mecanismo de morte celular pró-inflamatório, visto que leva ao extravasamento de padrões moleculares associados a dano, aumentando a severidade do processo inflamatório. A necroptose é uma forma programada de necrose e, de modo geral, conta com a ação das proteínas RIPK1, RIPK3 e MLKL. Resultados preliminares do nosso grupo apontam que macrófagos morrem por necroptose durante a infecção pelo VSR, e que ela é dependente de RIPK3 e de MLKL. Também foi visto que camundongos que tiveram seus macrófagos alveolares depletados apresentavam uma menor perda de peso quando infectados com VSR, o que é uma evidência inicial do papel dos macrófagos no aumento da severidade da doença. O objetivo deste trabalho é analisar mais profundamente esse processo, dando foco à expressão de mRNA das proteínas RIPK3 e MLKL. Macrófagos peritoneais murinos elicitados com tioglicolato foram estimulados com VSR ou VSR inativado em diferentes concentrações (105 até 107 PFU/mL) durante diferentes tempos (2, 4 e 6 horas), corados com um corante de viabilidade para marcar células necróticas e analisados por citometria de fluxo. Pulmões de camundongos pré-tratados com clodronato (para depleção de macrófagos) ou PBS e infectados com VSR foram coletados após 5 dias de infecção. Os níveis de mRNA de Ripk3 e de Mlkl nas células e nos pulmões, assim como a carga viral nos pulmões, foram medidos por PCR em tempo real. Macrófagos peritoneais infectados com RSV in vitro apresentaram níveis aumentados de Mlkl, mas não de Ripk3. Camundongos infectados com RSV que tiveram seus macrófagos alveolares depletados apresentaram menor carga viral e menores níveis de Mlkl e de Ripk3 nos pulmões. Concluímos que os macrófagos alveolares podem aumentar a severidade da doença causada pelo VSR, e que a necroptose é diretamente relacionada a esse processo.