Avaliação da estabilidade físico-química e biológica de plasmídeos com potencial biotecnológico

• Autor(a) principal: Monte, Jéssyka Fernanda Santiago
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRN
• Texto Completo: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/23716
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA; Plasmídeo; Degradação; Estabilidade; Nucleases; Terapia gênica

Estudos envolvendo estabilidade de plasmídeos tiveram início há pelo menos duas décadas e vem crescendo nos últimos anos, desde que os pDNAs apresentaram um enorme potencial como vetores em terapia gênica. O uso terapêutico desses vetores tem sido dificultado por questões de estabilidade, principalmente no que se refere ao processo de produção e purificação, armazenamento por longos períodos e serem susceptíveis à degradação por nucleases. Assim, ensaios que permitam analisar estes processos que levam a instabilidade do pDNA podem ser ferramentas importantes para sua compreensão, associado a outras variáveis, tais como temperaturas, tempo de armazenamento, tamanho do pDNA, presença de sequências procarióticas e ação nucleásica, assim E. coli DH5-α competente foi produzida, transformada com os pDNAs estudados (pVAX1, pVAX1lacZ e MSPpVAX1), purificados e armazenados em diferentes temperaturas por um intervalo de tempo pré-determinado e para estabelecer uma relação entre a estabilidade dos diferentes pDNAs e sua função biológica enquanto vetores, estudou-se a resistência da isoforma super-enrolada à ação da nucleases de soro em diferentes concentrações e ao longo do tempo. Para tal, eletroforese em gel de agarose e transformação em E. coli com cálculo da eficiência de transformação celular foram realizados. Foi observado ao longo do tempo que a integridade do pDNA super-enrolado foi perdida em função do tempo e da temperatura de armazenamento, além disso, os pDNAs contendo sequências apenas procarióticas se mostraram mais resistente a esses fatores quando comparado ao que possuía sequência procariótica, mostrando que há influência desses fatores na estabilidade do pDNA. Em relação à ação nucleásica, o maior plasmídeo foi mais acometido pela atividade dessas enzimas. Quanto a função biológica, os ensaios de eficiência de transformação em E. coli indicaram que houve uma maior percentagem de células transformadas quando era utilizado plasmídeo na conformação super-enrolada. Verificou-se em todos os ensaios, que a isoforma super-enrolada era sempre mais eficiente que as demais isoformas, devendo-se esse fato possivelmente à sua maior estabilidade citoplasmática e a difusão mais rápida desta isoforma em direção ao núcleo. Assim esse trabalho mostrou a cinética de degradação, passo a passo, dos pDNAs estudados, mostrando que a perda da forma super-enrolada compromete a estabilidade dos pDNAs, afetando dessa forma a função biológica dos mesmos, comprometendo sua utilização em terapia gênica e vacinas de DNA.